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[目的]目前,阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是全球医疗保健的研究热点,但是其致病原因仍不清楚。研究表明淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)的 C 末端胞内结构域(APP intracellular C-termial domain,AICD)具有转录因子活性,可以调控多种基因表达,且AICD转基因小鼠具有阿尔兹海默病症状,因此AICD逐渐成为阿尔兹海默病的研究新热点。前期研究发现TAG1是APP的功能性配体,能促进APP剪切出AICD,抑制胚胎神经干细胞(embryonic neural stem cells,eNSC)向神经元方向分化。己知阿尔兹海默病的病理学特点之一是神经元减少,因此TAG1-APP信号通路可能与阿尔兹海默病的发生、发展具有相关性,也可能是将来治疗阿尔兹海默病的潜在药物靶点。但是TAG1/APP结合后产生的AICD分子调控eNSC分化的具体机制目前仍不清楚。已知microRNA(miRNA)能够调控神经干细胞的增殖、分化、凋亡等多个过程。故推测在TAG1-APP信号通路中,AICD可能是通过调控miRNA的表达从而抑制了 eNSC向神经元方向的分化。另外,己知miRNA是通过调控下游靶基因mRNA表达发挥功能,因此我们将进一步筛选和验证TAG1-APP信号通路中miRNA的下游功能靶基因。[方法]首先,通过细胞免疫荧光实验和实时荧光定量PCR实验(realtime PCR)检测最佳胎鼠取材年龄和部位,分离培养eNSC。然后,通过分析SH-SY5Y细胞系中AICD ChIP-Seq实验结果、TAG1 KO和APPKO成体小鼠SVZ组织中miRNA microarray实验结果筛选出与AICD、TAG1和APP相关miRNA作为初筛miRNA。再通过real time PCR检测初筛miRNA中在分离培养的eNSC里同时受AICD、TAG1和APP调控的miRNA,将其作为候选miRNA。接着主要通过real time PCR、细胞免疫荧光实验和细胞计数分析检测候选miRNA在神经系统中的表达情况,在eNSC增殖、分化、凋亡过程中的功能以及其能否有效逆转AICD、TAG1和APP对eNSC分化为神经元的影响。最后,主要通过mRNA microarray实验、生物信息学预测和real time PCR实验筛选受AICD和候选miRNA调控的下游靶基因,并通过双荧光素酶实验确定候选miRNA和下游靶基因的靶向关系。再通过real time PCR实验、免疫荧光实验检测靶基因的mRNA-和蛋白质在神经系统的表达情况。进一步通过细胞免疫荧光实验和细胞计数分析检测靶基因对eNSC分化为神经元的影响以及其能否有效逆转候选miRNA对eNSC分化为神经元的作用。[结果]研究发现分离胎龄14天(E14)小鼠的前脑组织能培养出纯度为98%左右的具有增殖和分化能力的优质NSC用于后期实验。通过分析AICD ChIP-Seq实验和miRNA microarray实验共筛选出10个与AICD、TAG1和APP有关miRNA。进一步通过real time PCR实验发现在eNSC中只有miR-218-5p的表达同时受AICD、TAG1和APP的调控。随后,通过real-time PCR实验、细胞免疫荧光实验和细胞计数分析发现miR-218-5p在小鼠神经系统中的表达具有时空特异性和细胞特异性,并具有促进eNSC增殖、抑制eNSC向神经元分化的功能,但它对eNSC和诱导分化的eNSC的凋亡没有影响。另外还发现miR-218-5p能有效逆转AICD、TAG1和APP对eNSC分化为神经元的影响。最后通过mRNA microarray实验、生物信息学预测、real time PCR实验以及双荧光素酶报告实验发现Phc3是miR-218-5p的下游靶基因。并且发现Phc3 mRNA在神经系统中的表达具有时间特异性、Phc3蛋白在神经系统中的表达具有细胞亚结构特异性、Phc3 siRNA抑制eNSC向神经元方向的分化,还能有效逆转miR-218-5p inhibitor对eNSC分为神经元的上调作用。[结论]本课题主要发现TAG1/APP结合产生AICD后主要通过调控miR-218-5p的表达抑制体外分离培养的eNSC向神经元方向的分化,而在此过程中miR-218-5p可以通过调控Phc3的表达来完成此功能。本课题详细研究了TAG1-APP信号通路的具体过程,为进一步深入研究此信号通路在阿尔兹海默病发生、发展过程中的作用及其潜在治疗价值提供前期研究基础。