十字花科黑腐病菌(野油菜黄单胞菌野油菜致病变种,Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原细菌,是研究植物病原细菌与寄主分子相互作用的模式细菌之一。该病菌在寄主植物上的致病性主要由两个致病性调控系统决定:过敏反应与致病性(hypersensitive response and pathogenicity,hrp)基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(typeⅢ secretion system,T3SS)和响应可扩散因子(diffusible signaling factor,DSF)信号的致病因子调控系统(regulation of pathogenicity factors,rpf)。T3SS在许多动、植物病原细菌和寄主互作过程中起着极其重要的作用。病原细菌通过T3SS将毒力蛋白Ⅲ型效应物(type Ⅲ secreted effectors,T3SEs)分泌并转运(translocate)至寄主细胞体内,从而引起致病或过敏反应(hypersensitive response,HR)。黄单胞菌 T3SS 由 hrp基因簇(XC3001～XC3025)编码,其关键调控蛋白为AraC类蛋白HrpX(XC3076)、OmpR家族反应调节蛋白HrpG(XC3077)和双组份反应调节系统感受蛋白HpaS(XC370)。黄单胞菌hrp/T3SS在营养贫瘠培养基或植物体内受诱导表达,而感受的环境诱导信号包括植物内源诱导信号尚不清晰。HpaS感受某未知信号,自激活,然后将磷酸基团传递给HrpG,活化后的HrpG激活hrpX表达,HrpX再激活其他hrp基因和T3SE基因表达。另外还报道了 HpaR、HpaR1、HpaR2、HpaP、RsmA、Zur 等各类蛋白参与hrp调控。rpf/DSF系统至少调控植物细胞壁降解胞外酶、胞外多糖、生物聚膜形成、运动性等致病因子,其关键调控蛋白为双组份系统感受蛋白RpfC、反应调节蛋白RpfG和全局转录调节蛋白Clp。据报道c-di-GMP与Clp结合,阻止Clp与下游靶标基因结合,从而抑制胞外酶、胞外多糖等合成。在丰富培养基中,细菌群体密度高于某阈值,RpfC感受环境高浓度DSF信号,自激活后磷酸化RpfG,RpfG含有HD-GYP结构域,参与降解环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP),降低胞内 c-d i GMP 浓度,释放 Clp,从而激活胞外酶、胞外多糖等合成。病原菌侵染寄主植物必需依赖各致病系统、诸多致病因子相互协作,然而rpf/hrp两大致病调控系统之间是否协作、是否相互调控,目前鲜见报道。本研究利用十字花科黑腐病菌蔗糖敏感自杀基因sacB融合hrpX启动子构建的报告质粒pL6hrpXsacB导入Xcc8004获得的报告菌株8004/pL6hrpXsacB,利用EZ-Tn5复合转座子,构建突变体库,在含5%蔗糖的基本培养基MMX上筛选hrpX表达降低的突变体。获得一株突变体(命名为XB003),经质粒拯救后测序定位,发现XB003中转座子插入在ORFXC2333内,XC2333编码rpf致病调控系统的关键调控蛋白RpfC。利用荧光实时定量PCR检测十字花科黑腐病菌Xcc 8004和rpfC缺失突变体△rpfC在基本培养基XCM1上hrpG、hrpX的表达情况。结果显示,在基本培养基XCM1上Δ rpfC中hrpX的mRNA量显著低于野生型菌株Xcc 8004 中 hrp 的 mRNA 量(p<0.01,t test),但△ rpfC 中 hrpG的 mRNA量与野生型菌株Xcc 8004中hrpG的mRNA量相比无显著差异(p>0.05,t test)。进一步利用GUS报告系统验证。分别构建了 hrpX、hrpG启动子融合GUS报告系统,获得报告质粒pGUShrpG和pGUShrpX,将报告质粒通过三亲本接合分别导入野生型菌株Xcc 8004和Δ rpfC,获得报告菌株8004/pGUShrpG、ΔrpfC/pGUShrpG、8004/pGUShrpX 和 ΔrpfC/pGUShrpX。在基本培养基XCM1、XCM1+寄主植物满身红萝卜组织提取液和寄主植物满身红萝卜体内分别检测hrpG、hrpX表达。结果显示,在基本培养基XCM1和XCM1+寄主植物满身红萝卜组织提取液中,rpfC缺失突变后hrpX表达显著下调,hrpG表达无显著差异;而在寄主植物满身红萝卜内,rpfC缺失突变后hrpG、hrpX表达都显著下调。上述结果表明在基本培养基上和植物体内RpfC正向调控hrpX表达;RpfC在基本培养基上不调控hrpG表达,但在植物体内正向调控hrpG表达;暗示在不同的培养条件下,RpfC采用不同的机制激活hrpX表达。辣椒ECW-10R(Capsicum annuum cv.ECW-10R)为Xcc 8004非寄主植物,含有Bs1抗性基因,Xcc 8004含有AvrBs1无毒蛋白,可在辣椒ECW-0R(Capsicum annuum cv.ECW-10R)上诱发Ⅲ型特异性过敏反应。既然RpfC正向调控hrpX表达,RpfC是否影响HR必须检测。为此,检测了Xcc 8004、rpfC缺失突变体△rpfC和反式功能互补菌株C△rpfC的过敏反应(HR),以不产生HR的avrBs1缺失突变体△avrBs1为负对照。定性HR试验结果显示,rpfC缺失突变体接种8 h后未出现可见HR症状,而野生型Xcc 8004菌株出现典型HR,接种16 h后除Δ avrBs1外其他所有检测菌株都出现典型HR。通过电解质渗漏试验进一步检测定量HR,结果显示,接种后8 h、16 h、24 h,rpfC缺失突变体引起的辣椒ECW-10R电解质渗漏都显著低于野生型Xcc 8004菌株,而反式功能互补菌株接种后24 h可恢复野生型表型。上述结果表明rpfC缺失突变引起过敏反应显著延迟和降低。为进一步研究RpfC正向调控hrpX表达机制,首先利用RNA-deep sequencing进行转录组分析,鉴定RpfC、RpfG和Clp在基本培养基上的所有调控基因。转录组分析结果显示,与野生型相比,527个基因在rpfC缺失突变体中差异表达,其中328个基因显著下调,199个基因显著上调;重要的是,整个hrp基因簇25个hrp基因、hrpX基因和已报道的9个Xcc Ⅲ型效应物基因的表达都显著下调,clp和hrpG基因的表达不受影响。在rpfG缺失突变体中,610个基因差异表达,其中277个基因显著下调,333个基因显著上调;10个hrp基因簇基因和8个Xcc Ⅲ型效应物基因的表达都显著下调,但hrpG、hrpX和clp基因的表达都不受影响。在clp突变体中,共有376个基因差异表达,包括137个下调基因,239个上调基因;23个hrp基因簇基因和9个Xcc Ⅲ 型效应物基因的表达都显著下调,hrpX基因的表达也显著下调,而hrpG基因的表达不受影响。转录组分析结果显示,在基本培养基上RpfC和Clp都正向调控hrpX、hrp基因簇和Ⅲ型效应物基因表达;而RpfG仅调控部分hrp基因簇和Ⅲ型效应物基因表达,不调控hrpX表达。RpfC调控胞外酶、胞外多糖等合成是通过控制c-di-GMP浓度调节Clp活性的,RpfC在基本培养基上调控hrpX是否依然采用此机制?为此,测定了Xcc 8004、rpfC缺失突变体和rpfG缺失突变体在丰富培养基NYG和基本培养基MMX上细菌胞内c-d i-GMP浓度。结果显示,在基本培养基MMX上,细菌胞内c-d i-GMP浓度约为在丰富培养基NYG上胞内c-d i-GMP浓度的1/10;与野生型相比,无论是在丰富培养基NYG,还是在基本培养基MMX上,rpfC缺失突变体和rpfG缺失突变体一样,细菌胞内c-di-GMP浓度都显著提高,rpfG缺失突变体中c-di-GMP浓度甚至高于rpfC缺失突变体中c-di-GMP浓度(p<0.01,ttest)。暗示在基本培养基MMX上,RpfC调控hrpX基因可能不通过控制c-di-GMP浓度调节Clp活性实现。Clp通过与靶标基因启动子区结合调控胞外酶、胞外多糖等合成。那么Clp调控hrpX的分子机制是否依然如此?Clp调控的靶标基因启动子区常有Clp结合位点(Clp binding sites,CBSs),CBSs典型模序为5’-AAATGTGA-TCTAGA-TCACATTT-3’。我们利用生物信息学分析 cc 8004 hrpX启动子区,发现了 11个假定的Clp结合位点,匹配度最高的CBS为70%,命名为CBS-1。为检测Clp是否直接结合于hrpX启动子,表达纯化了 Clp蛋白,利用荧光素酰胺(FAM)标记hrpX启动子探针,进行凝胶电泳迁移试验(EMSA)检测。结果显示Clp可与CBS-1产生显著迁移,而与CBS-2和CBS-3不产生迁移;表明Clp可与hrpX启动子区CBS-1稳定结合。为研究hrpX启动子区CBS-1对Clp调控hrpX的贡献,对CBS-1及另外两个可能的CBS(CBS-2和CBS-3)进行融合PCR介导的定点突变,结果发现CBS-1点突变后Cl p不再调控hrpX,而另外两个CBS点突变后Cl p依然调控hrpX,表明C lp对hrpX的调控依赖CBS-1。在基本培养基上RpfC和Clp正向调控hrpX,不调控HrpG;RpfG不调控hrpX和HrpG。那么RpfC是如何绕过RpfG通过Clp调控hrpX的?为鉴定RpfC下游未知反应激活蛋白,利用细菌双杂交(Bacterial two-hybrid system,B2H)对Xcc 8004基因组注释的反应调节蛋白进行筛选鉴定。完成了 RpfC与65个反应调节蛋白的细菌双杂交检测,结果显示RpfC可能与RpfG、XG0198、XC0816和XC3059互作。HR检测结果显示XC3059影响HR,XC0816不影响HR;且XC0816和XC3059均与Xcc 8004致病相关;但GUS检测结果表明XC0816和XC3059不调控hrpG和hrpX表达。结果表明RpfC调控hrpX可能不通过XC0816和XC3059。RpfC调控hrpX所依赖的下游未知反应激活蛋白亦可能在翻译水平或翻译后水平上受影响。为进一步搜寻鉴定RpfC下游未知反应激活蛋白,利用蛋白组学iTRAQ技术鉴定了Xcc 8004、rpfC突变体、rpfG突变体、rpfF突变体和clp突变体在基本培养基上的差异蛋白组。结果显示,与野生型相比,rpfC突变体中433个蛋白差异表达,rpfG突变体中382个蛋白差异表达,rpfF突变体中445个蛋白差异表达,clp突变体中944个蛋白差异表达。HrpX在rpfC突变体中、rpfG突变体中和clp突变体中表达都显著下调。根据蛋白组数据,分析c-di-GMP分解相关的11个HD结构域蛋白、2个HDOD结构域蛋白、14个EAL结构域蛋白、c-d i-GMP合成相关的29个GGDEF蛋白的差异表达情况,发现含有GGDEF结构域和cNMP_binding结构域的保守假定蛋白XC0249在rpfC突变体中表达上升,同时含有GGDEF和EAL结构域的蛋白XC1582在四个突变体中表达都下降。这些可作为候选基因进行后续RpfC调控hrpX分子机制研究。