目的：课题组前期研究发现淡豆豉有明显的抗骨质疏松活性，并确认淡豆豉总黄酮为对抗骨质疏松的有效部位，但尚不清楚具体作用的有效成分。本研究采用紫外-可见分光光度法（UV法）测定不同产地淡豆豉总黄酮含量并进行性状观察比较，建立淡豆豉总黄酮的含量检测方法，保证淡豆豉的质量；同时实验室自己提取分离淡豆豉的有效成分，应用HPLC-ESI-MS/MS技术对其进行分析鉴定，使其独立作用于体外培养大鼠成骨细胞，从细胞水平观察其对成骨细胞增殖的作用和相互作用，进一步明确其物质基础。方法：1中药淡豆豉的质量研究1.1薄层色谱鉴别条件以三氯甲烷-甲醇-水（9：2：1）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，点于硅胶GF254薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。1.1.1淡豆豉中辅料桑叶、青蒿的鉴别1.1.1.1薄层条件点于硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5：4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。1.2不同产地（含自制）淡豆豉的观察及UV法对其中总黄酮含量的测定1.2.1对不同产地淡豆豉性状进行观察，包括表面颜色、菌毛颜色等1.2.2UV法对其中总黄酮含量的测定条件以染料木素为对照，样品测定以0.01mol/L NaOH溶液为空白溶液，在261nm处测吸收度，并绘制标准曲线。1.3HPLC法测定淡豆豉中大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素和染料木苷含量1.3.1色谱条件HPLC梯度洗脱梯度为：0-10min，13％A，87％B；10-40min，25％A，75％B：40-55min，30％A，70％B；55-65min，80％A，20％B。流量为1mL/min；检测波长为261nm，柱温为室温，进样量为25μL。1.4利用液质联用技术HPLC-ESI-MS分析鉴定淡豆豉中黄酮类成分1.4.1色谱条件HPLC线性洗脱梯度为：0-10min，13％A，87％B；10-40min，25％A，75％B：40-55min，30％A，70％B；55-80min，80％A，20％B。流量为150μL/min；柱温为室温。进样量为0.3μL。1.4.2质谱条件采用正、负离子检测方式。喷雾电压4.0-5KV；毛细管电压+15或-20；毛细管温度300℃；鞘气流速：40arb；辅助气流速：50arb；管透镜补偿电压：+18或-40；一级质谱扫描范围m/z300-1500；碰撞能量：30％-40％。1.5淡豆豉化学成分研究1.5.1淡豆豉的制备方法取安国黑豆20kg，挑洗晾干。称取青蒿桑叶各10kg，蒸煮发酵置于烘箱内37℃，放置7天，取出，即淡豆豉。1.5.2淡豆豉活性成分提取取淡豆豉约20kg，用石油醚脱脂，75%的乙醇回流提取，收集上清液，浓缩，留浸膏。1.5.3淡豆豉活性成分的分离1.5.3.1淡豆豉活性成分的粗分将提取后得到的浸膏，分别一次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集上清液，浓缩，得到的浸膏。1.5.3.1.1乙酸乙酯部分的粗分将挥干后的乙酸乙酯层称重，用石油醚和乙酸乙酯溶解后与硅胶拌样，置于大的布氏漏斗内，分别用石油醚、石油醚和乙酸乙酯不同比例、乙酸乙酯、乙酸乙酯和甲醇比例、甲醇进行淋洗，分别合并滤液，浓缩，得浸膏。1.5.3.1.2正丁醇部分的粗分将烘干的正丁醇部分称重，上大孔树脂柱，并用不同浓度的乙醇进行冲洗，分别合并流出液，浓缩，留渣。1.5.3.2乙酸乙酯层的细分将以上得到的乙酸乙酯部分，分别通过硅胶、MCI、以及反相C-18柱，并结合薄层技术进行分离。1.5.4淡豆豉化学成分结构的鉴定将以上得到的各种单体与黄酮对照品，应用核磁技术，对所得单体的结构进行鉴定。2抗骨质疏松的物质基础研究2.1淡豆豉化学成分对成骨细胞的增殖影响2.1.1大鼠颅骨成骨细胞（OB）原代培养与鉴定依据改良的组织块法，分离培养新生（24h内）SD大鼠颅骨成骨细胞。用碱性磷酸酶染色方法来鉴定成骨细胞，并在倒置显微镜下观察细胞的形态。2.1.2MTT法检测淡豆豉化学成分对体外培养OB细胞的增殖影响将已确定的分离得到的不同单体样品的浓度梯度设为（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L），作用时间为24h；MTT法测定各孔的存活率，以OD值表示。结果:1薄层鉴别结果经过薄层色谱鉴别可见，在供试品色谱与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的主斑点，斑点清晰，Rf值符合要求。经过薄层色谱鉴别，以桑叶和青蒿药材作为对照，利用同一块薄层板同一展开剂系统同一检视方法同时进行鉴别，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的主斑点，斑点清晰，分离效果理想。2UV测定淡豆豉总黄酮含量结果其中含量最高的为山东鄄城（2011年）样品5.14%，最低的为广东阳江（2011年）样品0.911%，两者相差4倍。3HPLC对淡豆豉中大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素、染料木苷六种化合物含量的测定结果3.1方法学考察结果3.1.1线性关系以对照品浓度（μg/mL）（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。3.1.2精密度试验考察结果大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素、染料木苷六种对照品含量RSD值分别为0.572%、0.829%、0.498%、0.831%、0.773%、0.557%，表明仪器精密度良好。3.1.3稳定性试验考察结果在检测的48小时内，大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素、染料木苷对照品溶液的含量稳定，RSD值分别为0.562%、1.002%、0.636%、1.809%、1.194%、0.551%，稳定性较好。3.1.4重复性试验考察结果由6次测定结果，对大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素、染料木苷的含量测定，其RSD值分别为1.553%、2.198%、2.158%、1.838%、1.731%、1.759%，说明方法的重现性良好。3.1.5回收率试验考察结果加样回收实验表明，大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素、染料木苷的平均回收率分别为100.620%、100.210%、100.510%、101.880%、98.599%、98.953%，RSD值分别为0.727%、2.243%、0.944%、1.125%、1.376%、2.287%（n=9），说明方法准确可靠。4HPLC-ESI-MS/MS成分分析从HPLC-ESI/MS/MS总离子流图和HPLC图谱中可以看出，多数成分来自于原料黑豆，通过正、负离子碎片离子信息，鉴别出1个来自于桑叶中的黄酮Atalantoflavone，和2个来自于青蒿中的黄酮青蒿黄酮和芹菜素。其他黄酮均来自于原料药黑豆，分别为大豆苷元、染料木素、黄豆黄素3种黄酮及其及苷类成分。5淡豆豉化学成分的研究5.1淡豆豉中化合物结构的鉴定将从淡豆豉中提取分离的到得到的化合物，在核磁作用下对其进行了结构鉴定，分别为丁香酸syringic acid（Ⅰ）、大豆苷（Ⅱ）daidzin、大豆苷元daidzein（Ⅲ）、黄豆黄苷glycitin（Ⅳ）、黄豆黄素glycitein（Ⅴ）、染料木素genistein（Ⅵ）、染料木苷genistin（Ⅶ）、芹菜素Apigenin（Ⅷ）、β-谷甾醇β-sitosterol（Ⅸ）、菜油甾醇（StigmasterolⅩ）、豆甾醇Campesterol（Ⅺ）。5.2淡豆豉化学成分对成骨细胞增殖的影响5.2.1成骨细胞形态观察和鉴定原代培养24h～36h，倒置相差显微镜下，可见自颅骨碎片爬出的成骨细胞，贴壁生长，呈放射状短梭形或三角形，细胞排列无方向性。传代细胞最初接种时呈球形，悬浮于培养液中，24h可见大部分细胞贴壁、伸展；培养3d后，OB形状基本稳定；培养5d左右细胞呈铺路石状。碱性磷酸酶染色：实验用碱性磷酸酶染色后，显微镜下观察可见胞浆内散在的紫蓝色沉淀，呈典型的ALP染色阳性反应。细胞染色深浅不等，阳性细胞多为长梭形和鳞片形，成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性率可达93%5.2.2淡豆豉化学成分对成骨细胞的增殖影响5.2.2.1大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黄豆黄素10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9mol/L时，MTT检测结果显示，大豆苷元、大豆苷、染料木苷、染料木素、黄豆黄素各药物组浓度在10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol/L时，随浓度的增加，细胞增殖明显，对细胞的增殖作用大豆苷元、染料木素、黄豆黄素优于大豆苷、染料木苷。但在10^-5mol/L时出现一定的细胞毒性。结论:1应用UV法对来自14个不同产地以及自制淡豆豉总黄酮含量测定，其结果表明不同产地淡豆豉主要成分的含量差异也很大。此外，相同产地不同存放时间的淡豆豉含量差异也很大。2淡豆豉中提取分离得到11种化合物，经过结构鉴定以及液质的成分分析，可确定其分别为大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素、染料木苷、丁香酸、芹菜素及植物甾醇类，对其中的大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木素及染料木苷六种化合物利用HPLC方法进行含量测定，并进一步对六种化合物进行活性研究3大豆苷元、大豆苷、染料木苷、染料木素、黄豆黄素在10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9mol/L时，大豆苷元、大豆苷、染料木苷、染料木素、黄豆黄素各药物对细胞的增殖活性与浓度在10^-910^-6mol/L呈现正相关趋势,随浓度的增加，细胞增殖明显，但在10^-5mol/L时出现一定的细胞毒性，提示：淡豆豉中提取得到的各黄酮类化合物，有明显的细胞增殖，且对细胞的增殖作用大豆苷元、染料木素、黄豆黄素优于大豆苷、染料木苷，淡豆豉具有较强的抗骨质疏松的活性。