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目的:运用酵母双杂交技术研究COX6B1蛋白与Sedlin蛋白的相互作用;构建带FLAG标签的COX6B1蛋白及COX6B1蛋白R20H、D74A两个点突变体的真核表达载体,分别转染至COS7细胞,观察它们在哺乳动物细胞内的定位情况和彼此间的区别;构建带GFP标签的Sedlin蛋白真核表达载体,转染至COS7细胞中观察其定位,并与带FLAG标签的COX6B1蛋白野生型及点突变体共转至COS7细胞,观察这两种蛋白在细胞内的共定位情况;将带 GFP标签的 Sedlin蛋白与带FLAG标签的COX6B1蛋白共同转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀实验,检测在哺乳动物细胞内COX6B1蛋白与Sedlin蛋白能否相互作用。 方法:以含人COX6B1全长cDNA序列的质粒为模板,PCR扩增COX6B1蛋白野生型DNA片段,插入到pGBKT7载体中,构建pGBKT7-COX6B1原核表达载体,并以此为模板用定点突变的方法构建 pGBKT7-COX6B1R20H、D74A两个点突变体。将它们分别与pGADT7-SEDL共同转化酵母菌AH109感受态细胞,SD培养基(﹣Trp/﹣Leu/﹣His/+3-AT)/X-α-gal上生长筛选蓝色,呈蓝色的克隆是X-α-gal活性为阳性克隆。 以pGBKT7-COX6B1为模板,通过上游带FLAG标签的引物,PCR扩增FLAG-COX6B1融合蛋白全长编码序列,目的片段经BamH I和EcoR I酶切后回收,回收片段插入到pCDNA3.1载体中,构建真核表达载体pCDNA3.1-FLAG-COX6B1,再以pGBKT7-COX6B1R20H、D74A为模板构建pCDNA3.1-FLAG-COX6B1R20H、D74A载体,后转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞中的定位与野生型的差别。将质粒pCDNA3.1-FLAG-COX6B1、R20H、D74A分别与pCDGFP-SEDL共同转染COS7细胞,通过免疫荧光的方法观察COX6B1蛋白及其点突变体和Sedlin蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒pCDNA3.1-FLAG-COX6B1与pCDGFP-SEDL共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,进行免疫共沉淀,后通过 Western blot检测在哺乳动物细胞内COX6B1蛋白与Sedlin蛋白能否结合。 结果:经酶切和测序鉴定,各重组质粒均构建正确。通过营养筛选及α-半乳糖苷酶活性的测定表明COX6B1蛋白野生型和两个点突变体都能和Sedlin蛋白相互作用。免疫荧光显示 COX6B1蛋白主要以斑点状分布于细胞质中,核内未见明显定位,两个点突变体与野生型蛋白定位未见明显区别,但表达效率不及野生型,Sedlin蛋白在细胞核、细胞质中均有定位。COX6B1蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中共同分布于细胞核周区域,COX6B1蛋白点突变体与Sedlin蛋白共定位和野生型相似。免疫共沉淀和Western blot检测证明COX6B1蛋白和Sedlin蛋白能在HEK293T细胞中相互结合。 结论:酵母双杂交结果表明COX6B1蛋白及点突变体与Sedlin蛋白均存在相互作用。免疫荧光实验显示COX6B1蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中共定位于细胞核周围区域,提示COX6B1蛋白和Sedlin蛋白在细胞内相互作用。COX6B1R20H、D74A在细胞内定位和野生型相似。免疫共沉淀实验表明COX6B1蛋白和Sedlin蛋白在哺乳动物细胞质能相互结合。