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布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一类动物源性人兽共患病，在世界范围内广泛流行，尤其是发展中国家。近几年回升势头迅猛。布鲁氏菌主要毒力表现在能侵入宿主细胞并在其中生存增殖形成持续性感染的能力。布鲁氏菌侵入宿主细胞后逃避与溶酶体融合以及抑制宿主细胞凋亡是其在胞内形成持续性感染的重要原因，目前大量的研究表明自噬与凋亡及溶酶体融合降解途径密切相关，布鲁氏菌激活自噬途径及其相关机制的研究尚不多见。 目的：本文以羊种布鲁氏菌参考株16M（以下简称16M）感染巨噬细胞为模型，研究布鲁氏菌感染巨噬细胞后：（1）是否激活巨噬细胞自噬途径。（2）自噬途径的激活对羊种布鲁氏菌胞内生存繁殖的影响。（3）羊种布鲁氏菌激活巨噬细胞的自噬对细胞凋亡的影响。（4）羊种布鲁氏菌激活巨噬细胞自噬对溶酶体与布鲁氏菌融合率的影响.探讨布鲁氏菌感染后激活自噬途径与细胞凋亡之间的关系以及对溶酶体途径的影响，揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制，为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。 方法：（1）通过对自噬泡特异性标记物GFP-LC3阳性点数的统计以及研究自噬最经典的方法电镜技术来监测羊种布鲁氏菌16M（16M）侵染巨噬细胞后细胞自噬活性的变化。(2）16M侵染巨噬细胞后，利用自噬的抑制剂3-MA抑制细胞自噬或利用RNA干扰技术沉默自噬泡形成过程中的必需基因Beclin-l，检测16M胞内CFU；同时用MTT法检测自噬抑制剂3-MA和Beclin-l干扰载体对巨噬细胞活性的影响.（3）用16M侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后，利用自噬抑制剂3-MA干预巨噬细或用RNA干扰技术沉默自噬起始基因Belclin-1后，用流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡率，用western-blot检测巨噬细胞自噬被16M激活和被Beclin-1干扰质粒抑制后Caspase-8,9激酶的活性变化以及细胞色素C的水平。（4）用可表达绿色荧光蛋白的质粒pWal-GFP电转化布鲁氏菌,将电转化质粒pWal-GFP的布鲁氏菌侵染溶酶体红色荧光探针Lyso-TrackerRed标记的巨噬细胞,用激光共聚焦显微镜观测布鲁氏菌和溶酶体的共定位区域。 结果：（1）与未侵染16M的对照组相比，在16M侵染组中：激光共聚焦显微镜检测到GFP-LC3阳性点数显著增多（p<0.05）；电镜检测到典型的双/多层膜自噬小体结构；western-blot检测显示自噬小体表面微管相关蛋白1的轻链3(LC3-II)的表达量显著提高，LC3-I向LC3-II的转化率在侵染12小时后达到最高水平。（2）在感染16M24h，48h时，自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后与对照组相比侵染组胞内布鲁氏菌数显著降低（P<0.05）；RNA干扰技术沉默自噬泡形成过程中的必需基因Beclin-l后胞内布鲁氏菌数也显著下（p<0.05）。MTT法检测3-MA和RNA干扰质粒均不影响细胞活性。（3）3-MA处理组巨噬细胞的凋亡率和Belclin-1干扰组的凋亡率均高于16M侵染组，并且差异性显著（P<0.05）。自噬抑制剂的应用和自噬起始基因的沉默在降低细胞自噬的同时，增强了细胞的凋亡比例；与16M侵染组相比Beclin-1干扰组细胞的Caspase-9的活性明显上调，而Caspase-8的活性则没有明显改变；3-MA组和Beclin-1干扰组中，细胞色素C明显高于16M侵染组。（4）胞浆中的红色颗粒状荧光即为溶酶体，绿色颗粒是布鲁氏菌,二者存在共定位区域（黄色）.随机选择100个细胞(视野)统计胞内黄色斑点数,添加3-MA自噬抑制剂后胞内黄色斑点数明显增多（p<0.05）。. 结论：16M可以激活巨噬细胞自噬途径，且有利于16M在宿主细胞内生存繁殖；16M激活的自噬途径能够降低布鲁氏菌与溶酶体的融合率，并通过抑制Caspase-9凋亡通路从而抑制宿主细胞的凋亡，自噬有利于16M在宿主细胞内存活的重要机制，为布鲁氏菌在宿主细胞内生存繁殖形成持续性感染提供了有利的条件。