[目的]建立表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌在多孔钛合金材料表面微生物生物膜体外模型;观察材料表面表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌形成的混合微生物生物膜及单一微生物生物膜在细菌生长特性、生长动力学、超微结构等方面的差异;为相关研究及临床工作提供相关理论依据。[方法]选用多孔钛合金材料作为实验材料。实验分组:表皮葡萄球菌标准株ATCC35984(生物膜形成阳性)单独培养组(表葡阳性组)、金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923 (生物膜形成阳性)单独培养组(金葡阳性组)、表皮葡萄球菌标准株ATCC35984 (生物膜形成阳性)和金黄色葡萄球菌菌标准株ATCC25923 (生物膜形成阳性)混合阳性培养组以上三组细菌分别与多孔钛合金材料混合培养,每组10例,共三个小组。将多孔钛合金材料(每组10例)分别浸没于400ul的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌,及两者的混合菌液中,置于35℃恒温培养箱中分别培养2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h,建立多孔钛合金材料表面体外生物膜模型,之后分别于各时间点将多孔钛合金材料取出,用结晶紫染色法染色,DMSO脱色15分钟后每孔取l00ul脱色液至96孔板,用微量酶标板测量仪测定490nm的吸光度,使用多功能酶标仪测定每孔在波长490nm处的光密度(OD)值,OD值的大小反应黏附能力的强弱,间接反映微生物形成生物膜的厚度,只加入TSB培养基作为空白对照。实际OD值为每个实验孔的OD值减去空白对照孔的OD值,实验重复6次。检测其生物膜形成能力。二甲基苯磺酸钠(XTT)比色法通过采用多功能酶标仪测定每孔脱色液在波长450nm处的OD值OD值的大小可以反应菌细胞活度。实际OD值为每个实验孔的OD值减去空白对照空的OD值,实验重复6次,以此来评价其生物膜体外生长动力学;使用激光共聚焦显微镜来检测各组中细菌生物膜的厚度、单位视野内菌群落数量,同时构建生物膜表面三维荧光图片;扫描电子显微镜来观察生物膜表面超微结构。[结果]:1.结晶紫染色法检测生物膜形成能力结果:表皮葡萄球菌组、金黄色葡萄球菌组及混合组,各实验组从6小时起开始有细菌生物膜形成,并在培养8h起细菌生物膜开始明显增厚,在培养12h--24h时时间段内,细菌生物膜生长趋势较平稳,细菌生物膜进入一缓慢增长增厚期,随着培养时间的延长,自培养24小时开始,生物膜继续生长增厚且增厚速度加快,自培养6h开始至继续培养到72小时整个过程中,混合阳性组细菌生物膜的厚度大于表皮葡萄球菌组和金黄色葡萄球菌单一组,表皮葡萄球菌组厚度大于金黄色葡萄球菌组。2. XTT比色法检测生物膜生长动力学结果:自培养开始至48小时之前,混合细菌组OD值低于表皮葡萄球菌单一组但高于金黄色葡萄球菌单一组,在48小时、72小时时间点混合细菌组OD值逐渐高于表皮葡萄球菌组,在整个培养过程中混合细菌组和表皮葡萄球菌组OD值始终高于金黄色葡萄球菌组;组间比较结果显示12h差异有统计学意义(P<0.05)。多孔钛合金混合细菌组,2h、4h,时间点OD值低于金黄色葡萄球菌组差异无统计学意义(P>0.05)。6h后各时间点,OD值显著高于金黄色葡萄球菌组,差异有统计学意义(P<0. 05)。3.激光共聚焦显微镜观察结果:多孔钛合金组材料和混合细菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌共同培养6h开始出现生物膜的生长,12 h时开始各组细菌生物膜开始明显增厚直至48 h为止,混合组及表皮葡萄球菌组细菌生物膜厚度达到最厚,到72 h时生物膜厚度趋于稳定,多孔钛合金混合细菌组在2h至72 h整个培养期间形成的生物膜厚度始终大于金黄色葡萄球菌组和表皮葡萄球菌单一组(P<0. 05),混合细菌培养组在多孔钛合金材料表面菌落数6h、12 h、24 h、48 h、72 h分别多于表皮葡萄球菌组金和黄色葡萄球菌单一细菌组,差异具有统计学意又(P<0. 05)。混合细菌组荧光图像及三维重建结果表明:混合细菌生物膜表面最终出现起伏不平丘状隆起,隆起的部分活菌含量较高,分部于丘状隆起间沟壑处的部分的死菌成分较多;生物膜断层扫描提示:混合细菌组在培养12h时外层的活菌比例高达90%,直至48小时活菌比例仍高达80%,共培养72小时时活菌比例下降至50%.活菌多处于生物膜凸起部位,死菌多位于混合生物膜凹陷部位,随着底层死菌比例的增高,表面活菌解聚释放,继续播散定植的可能性增大。混合细菌组多孔钛合金材料表面成熟生物膜结构较单一细菌组更复杂。激光共聚焦显微镜检测提示金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌在共培养6h、12 h、24h、48h、72h时,混合细菌组细菌生物膜较厚,混合细菌和单一细菌组生物膜厚度差异明显,有统计学意义(P<0. 05)。4.扫描电镜结果显示:随着培养时间增加,选取48h、72h两个生物膜形成较成熟的时间点作为观察对象,各组多孔钛合金材料随着培养时间的延长,表面都逐渐形成团块状、层叠样堆积起来的复杂立体结构状的混合生物膜,可见表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌菌呈团块状混杂生长,大量表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌形成多次层复杂团块状结构。与表皮葡萄球菌组和金黄色葡萄球菌单一细菌组相比,相同培养时间点的混合细菌多孔钛合金组生物膜结构更加复杂,立体层次结构更加明显,较金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌与材料表面的黏附更为紧密,生物膜外周金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌数量更多。[结论]1.生物膜形成阳性的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌混合培能在多孔钛合金材料表面形成比单一菌更厚、更致密,结构更为复杂的成熟的混合细菌生物膜。2.混合细菌组细菌在多孔钛合金表面粘附能力更强,材料的表面粘附的细菌菌落数也更多。3.混合细菌生物膜表面凸凹不平,凸起部位活菌比例较高,凹陷部位死菌比例较高,由内向外死/活菌的比例逐渐降低。4.混合细菌生物膜表面活菌较其他实验组更容易解聚释放,继续播散定植形成新的菌落,这可能是导致临床生物材料混合微生物感染迁延不愈,且较单一细菌感染更难控制的重要原因之一。