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目的:
本实验仅就肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,Mp)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans,Mf)、梨支原体(Mycoplasmapirum,Mpi)、穿通支原体(Mycoplasmapenetrans,Mpe)宫内感染导致各种不良妊娠结局予以探讨,建立上述四种支原体宫内感染动物模型,从而为临床实践提供理论与实验依据。
方法:
1.培养基:制备改良SP4(用于Mpe、Mpi、Mf和Mp的分离培养)液体和固体培养基。
2.标准菌株来源:已知对照菌株Mpe(GTU-54-6A-1)、Mf(ATCC19989)、Mp(ATCCl5531),Mpi(25960)均由东南大学医学院流行病学教研室赵季文教授惠赠。
3.菌液的制备:将保存于-20℃的冻干菌株接种于2ml改良SP-4培养基中,置于37℃,5%CO2孵箱中复苏,待菌种至最佳生长期,取0.2ml菌液接种于1.8mlSP-4培养基中,以此方法传3代待支原体生长至对数期收集离心后的沉淀物,并每次进行菌落计数,备用。
4.实验动物及分组:SD受孕大鼠,54只,体重180-230g/只,孕期12.5天,由温州医学院动物实验中心提供。生理盐水对照组11只;感染组共43只,其中Mpe、Mf和Mpi感染组各11只,Mp感染组10只。
5.模型的制备:大鼠受孕第12.5天开始感染,实验组用微量注射器吸取0.2ml对数生长期的支原体菌液(2×108-9CFU/ml);生理盐水组取0.2ml生理盐水,腹腔注射,连续注射3天。
6.母鼠及存活仔鼠观察:注射支原体后,观察孕鼠是否有流产、早产、死胎现象,各组间进行比较;待胎儿鼠出生后,定期观察其生长情况:观测体重、有无畸形及出生后死亡等情况,各组间进行比较,饲养1个月后解剖。
7.动物感染后支原体再培养:
7.1母鼠血液、子宫角以及死胎仔鼠的心、肺均进行支原体再分离培养。
7.2早产存活仔鼠生长至1个月在无菌环境下取每只母鼠的血液、子宫角组织进行培养:另每感染组选取9只早产仔鼠(要求其母鼠组织培养结果为阳性),取血液及各脏器进行培养;生理盐水组随机选取9只仔鼠取血液及各脏器进行培养。
8.血清细胞因子比较:各组早产存活仔鼠心脏无菌采血分离血清,采用ELISA法检测大鼠IL-10、TNF-α、IL-1β和IL-6,比较组间差异。
9.仔鼠各脏器电镜标本的制作与观察:分别取各感染组培养结果为阳性的仔鼠脑、心、肝、肺经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定,丙酮梯度脱水,Epon-812环氧树脂包埋,RMC-PT超薄切片机切片,半薄切片光镜定位于待观察的组织实质细胞部分,超薄切片经铅-铀双重染色,H-7500透射电镜下观察,拍片。
10.统计学处理:采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和Fisher确切概率法进行数据处理。
结果:
1.再培养结果四种支原体感染组孕鼠以及仔鼠各自分离到相应的支原体,生理盐水组孕鼠子宫角和仔鼠血液及心、肺均未分离到上述支原体。
2.四种支原体感染组流产、早产率为27.91%(12/43)。
3.四种支原体宫内感染孕鼠死胎及围产期死亡率为32.56%(14/43)。
4.四种支原体感染组早产仔鼠存活率为60.32%(76/126);本实验观察到的不良妊娠(包括自然流产、早产、死胎等)率为60.47%(26/43),与生理盐水组(0,0%)比较差异具有统计学意义(P<0.01)。
5.存活仔鼠生存状态观察感染组仔鼠与生理盐水组比较生长缓慢,体形瘦小,其中Mpi组有1只早产的仔鼠出现疑似脑瘫的症状,肌张力明显增高,生长缓慢,进食困难,于生后14天死亡。
6.血清细胞因子比较感染组早产存活仔鼠血清中IL-1β,IL-6,TNF-α和IL-10较生理盐水组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。
7.电镜观察结果显示仔鼠的心、肺、肝及脑组织内感染有支原体,并显示不同程度的炎症和损伤。
结论:
1.四种支原体宫内感染动物模型的建立,不但从血液及组织中分离到了相应的支原体,而且在电镜下观察到相应的病理改变,提示妊娠期子宫内感染上述四种支原体可导致流产、早产、死胎。
2.此四种支原体宫内感染可导致仔鼠感染以及心、肝、肺、肾、脑组织等重要器官损伤。
3.仔鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β以及IL-10结果升高与电镜下观察到的仔鼠的心、肝、肺、肾、脑组织炎症损伤相一致。