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目的:(1)采用H2O2诱导法建立胸腺上皮细胞衰老模型。将脐带间充质干细胞与衰老胸腺上皮细胞置于Transwell小室共培养,通过细胞形态、结构和功能观测,分析脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞的作用。(2)对正常、衰老和脐带间充质干细胞共培养后的胸腺上皮细胞进行全基因组甲基化和转录组测序并进行生物信息法分析,揭示脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞作用的表观遗传学及转录调控规律。(3)通过对三种状态胸腺上皮细胞的基因甲基化和转录组进行关联分析,阐明脐带间充质干细胞诱导胸腺上皮细胞基因组甲基化改变对基因转录组的影响及分子调控网络机制。方法:(1)本实验使用100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L的H2O2作用胸腺上皮细胞(TEC,Thymic epithelial cell)24 h、48 h、72 h、96 h,根据细胞的生长形态、增殖情况、细胞周期分析、β-半乳糖苷酶染色和P16、P21表达,筛选H2O2最佳浓度和时间。(2)将P4代脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)通过Transwell小室与衰老胸TEC共培养48 h。光学显微镜观察TEC数量;Nanolive4D显微镜连续观察TEC形态;透射电镜观察TEC超微结构;β-半乳糖苷酶染色检测TEC的β-半乳糖苷酶;Brd U染色检测TEC增殖活性;免疫荧光染色检测TEC P16表达。(3)通过全基因组甲基化测序分析UCMSCs对衰老TEC的DNA甲基化修饰谱变化规律。(4)通过转录组学测序分析UCMSCs对衰老TEC的转录组学调控规律,筛选关键基因及信号通路。(5)通过对基因组甲基化和转录组测序数据关联分析,说明DNA甲基化修饰对转录组学影响。(4)通过筛选差异m RNA、lnc RNA和mi RNA建立竞争性内源RNA调控网络,分析对m RNA的调控规律。结果:(1)胸腺上皮细胞衰老模型建立和评价正常TEC生长状态良好,呈鹅卵石样。在100μmol/L H2O2处理组,TEC生长情况无明显变化,200和300μmol/L H2O2处理组,TEC数量明显减少,400和500μmol/L H2O2处理组,TEC大部分死亡;细胞周期分析显示,正常对照组、200μmol/L、300μmol/L处理的TEC处于G0/G1期细胞比例分别为(41.33±1.69)%、(63.3±2.87)%、(41.6±1.52)%,采用200μmol/L H2O2与TEC共培养24 h、48 h、72 h、96 h后,正常TEC的增殖活力为(80.6±1.52)%,H2O2作用24 h、48 h、72 h、96 h的TEC增殖活力分别为(72.6±2.08)%、(64.6±4.04)%、(56.3±3.21)%、(53.3±3.05)%,其中H2O2处理72 h与96 h的TEC增殖活力无显著差别,最终选择200μmol/L H2O2处理72 h为诱导TEC衰老的适宜条件。以此条件批量诱导获得TEC衰老模型,符合TEC衰老要求。(2)UCMSCs与衰老胸腺上皮细胞共培养结果UCMSCs与衰老TEC共培养48 h后,TEC细胞数量增多。在共培养过程中Nanolive4D显微镜动态观察,UCMSCs分泌囊泡状物质进入衰老TEC中,使TEC体积由大到小,疏松细胞核变紧致;透射电镜观察衰老TEC出现异染色质聚集,呈斑块状分布,线粒体肿胀,胞内未见明显自噬小体,共培养后TEC细胞的染色质分布较均匀,线粒体仍然肿胀,胞内可见少量自噬小体;正常、衰老和共培养后TEC的β-半乳糖苷酶染色的阳性率分别为(6.33±1.52)%、(55.33±5.03)%、(31.33±7.09)%,Brd U染色阳性率分别为(91.66±1.24)%、(72.33±1.24)%、(90.66±1.24)%,P16阳性细胞比例分别为(35.6±5.08)%、(83.20±3.51)%、(55.90±5.13)%。以上结果说明,UCMSCs与衰老TEC非接触培养,可通过分泌细胞因子和外泌体,促使衰老TEC的细胞形态、结构、增殖能力和衰老基因P16表达水平等指标向正常TEC方向逆转。(3)全基因组甲基化测序数据分析结果WGBS测序数据分析结果显示,UCMSCs共培养后,TEC整体甲基化水平上升。与对照组相比,模型组中有120个基因发生去甲基化修饰,经UCMSCs共培养后有47个基因发生了甲基化修饰。其中有5个基因主要参与正调控凋亡、细胞周期阻滞等生物学过程,说明经过UCMSCs共培养后,使促进衰老相关基因发生了甲基化修饰进而逆转TEC衰老。与对照组相比,模型组中132基因发生甲基化修饰,经UCMSCs共培养后有74个基因去甲基化。其中有10个基因参与细胞发育、分化和成熟等生物学过程,这些结果说明,经过UCMSCs共培养后,使促进生长发育相关基因发生了去甲基化修饰改变逆转TEC衰老。(4)RNA-seq测序分析结果与正常TEC相比,衰老TEC中有1585个基因转录水平上调,共培养后下调的基因21个,主要参与细胞凋亡、细胞衰老等生物学过程;与正常TEC相比,衰老TEC中有1187个基因转录水平下调,共培养后有55个基因转录上调,这些基因主要参与上皮细胞增殖、上皮细胞分化等生物学过程。通过RT-q PCR分析5个m RNA:VEGFA,EPHA2,BDNF,MYC,PIK3R1相对表达量,与RNA-seq测序结果变化一致。Western blot和免疫荧光结果显示,经过UCMSCs共培养后,PI3K、AKT、CDK2和CCNE表达水平升高而P27的表达降低。这说明UCMSCs激活PI3K-AKT信号通路,促进了TEC的分裂增殖活性。(5)基因甲基化与m RNA的关联性与正常TEC相比,衰老TEC中有1个TF SATB1的甲基化水平升高引起转录水平下降,其中FN1、TNC、EFNA1和KIT是TF SATB1的靶点,表达水平呈正相关。这些结果说明,在H2O2作用TEC的过程中,通过使TF SATB1发生甲基化引起转录水平下降,进而靶向调控FN1、TNC、EFNA1和KIT的表达水平,使其降低,进而诱导TEC衰老。与衰老TEC相比,USMSCs共培养后使TF HES4的甲基化水平下降引起转录水平上调,其中C8orf44-SGK3、FUBP1、RACGAP1和HGH1是TF HES4的靶点,HES4和C8orf44-SGK3、FUBP1、RACGAP1、HGH1的表达水平呈正相关。这些结果说明,在UCMSCs共培养衰老TEC的过程中,通过使TF HES4发生去甲基化引起转录水平上升,进而靶向调控C8orf44-SGK3、FUBP1、RACGAP1和HGH1的表达水平,使其升高,进而逆转TEC衰老。(6)竞争性内源性RNA网络调控基因表达与正常TEC相比,模型组中有33个lnc RNA竞争结合6个mi RNA,使8个m RNA表达上调和11个下调;经过共培养后使14个lnc RNA表达上调,竞争结合3个mi RNA使其表达下调,促使11个m RNA表达上调。发现其中有10个基因主要参与促进上皮细胞分化过程、对生长因子刺激反应等生物学过程。结论:(1)采用H2O2与TEC共培养成功建立了衰老TEC模型,该细胞模型呈现衰老细胞形态,β-半乳糖苷酶表达水平升高,增殖活力降低和P16蛋白表达水平增高,呈现衰老细胞形态。(2)建立了UCMSCs与TEC的共培养体系,发现UCMSCs通过分泌囊泡状物质进入TEC,从形态、结构和功能上逆转TEC的衰老状态,增强增殖活力可使TECβ-半乳糖苷酶和P16蛋白表达水平下降。(3)UCMSCs共培养使衰老TEC的5个抑制生长的基因的甲基化水平上调,10个促进生长的基因甲基化水平下调,表明UCMSCs通过调节基因甲基化修饰水平逆转TEC衰老。(4)UCMSCs共培养使衰老TEC中21个促进凋亡、抑制生长的基因转录水平下降,55个促进细胞发育的基因转录水平上调,表明UCMSCs通过调节转录组逆转衰老。(5)UCMSCs通过调节基因甲基化修饰进一步影响基因转录谱改变,激活PI3K-AKT信号通路,调节ce RNA分子网络,最终促进TEC的分裂增殖。