由于环境恶化和生活方式的改变,恶性肿瘤已经成为新世纪人类死亡的主要原因,治疗难度大,治愈率低,极易复发和转移。与恶性肿瘤发生发展相关的靶点众多,其中BRAFV6000E突变与恶性黑色素瘤,甲状腺癌,结肠癌及卵巢癌等癌症的发生,侵袭,转移等有密切联系,因此BRAFV600E逐渐成为抗癌药物研究的热门靶点,开发小分子BRAFV600E抑制剂已成为抗肿瘤药物的研究热点。目前已经上市的小分子BRAFV6000E抑制剂耐药性、复发性和副作用等问题日益凸显,因此设计新颖更有效的此类抑制剂将具有重要意义。本课题针对BRAFV600E靶点,通过研究受体蛋白BRAFV600E立体结构的作用位点及已知的从BRAF共晶体中提取的内源性配体构效关系,利用计算机辅助药物设计方法,设计并合成了 24个含乙酰胺键的吡唑类衍生物。所有化合物的结构都通过1HNMR、13CNMR、ESI-MS方法得到确认。随后,对目标化合物进行了体外抗肿瘤增殖实验,BRAFV600E蛋白抑制活性实验,细胞凋亡实验,细胞周期阻滞及线粒体膜电位实验评估了 24个化合物的抗肿瘤活性。以vemurafenib作为阳性对照(A375细胞IC50=1.05±0.10μM,BRAFV600E IC50=0.04±0.004μM),化合物5r表现出较好的抗肿瘤细胞增殖活性(A375 细胞 IC50=0.96±0.10μM)和 BRAFV600E 蛋白抑制活性(IC50=0.1 0±0.01μM)。除此之外,化合物5r能诱导A375细胞凋亡,通过破坏线粒体跨膜电位,诱导A375细胞发生不可逆的程序化细胞死亡,并能够将A375细胞周期阻滞在G1期。分子对接模型表明,化合物5r可以紧密结合在BRAFV600E(PDB编码:4xv9)的活性位点上。基于以上实验结果,以化合物5r为代表的该系列24个化合物有望继续开发成为新型治疗剂,3D-QSAR模型的构建也为设计和优化更有效的此类抑制剂提供了指导,为进一步研究奠定了基础。甘草是我国传统中草药,含有多种有效成分,具有广泛药理活性。目前在甘草开发实践中,大多以提取甘草酸为主,而舍弃了废渣中包含的其他成分,造成了资源的极大浪费。光甘草定存在于光果甘草中,因安全而显著的黑色素抑制效果获得了“美白黄金”的美誉,同时其在抗氧化,抗肿瘤等方面也具有显著的效果,在医药、食品、化妆品等领域具有广阔的应用前景。然而由于甘草中物质成分复杂,光甘草定含量稀少,生产成本过高,难以化学合成等问题,光甘草定的产业化生产研究进展缓慢,至今没有完整的大规模生产工艺路线,进而严重影响了其新药设计等其他方面的研究进度。同时,经研究发现光甘草定因其水溶性差的特点严重影响了其应用范围和使用效果。本课题首先提取纯化分析甘草渣中主要成分。共获得包含光甘草定在内的6种化合物,所有的化合物都利用1H NMR,ESI-MS和13C NMR进行分析,最终确定其化学结构。其次优化光甘草定制备生产工艺条件,并进行工艺生产路线设计。原料为甘草渣,设定提取溶液甲醇含量,提取时间,提取温度和提取次数四个变量,采用正交实验方法,以浸膏得率和黄酮含量为标准,最终选择提取溶液70%-80%甲醇含量,提取时间1h,提取温度100℃,提取次数2次为最优条件。选择聚酰胺层析柱纯化光甘草定,甘草渣用80%甲醇提取,提取液稀释至60%-70%甲醇含量,用第一根聚酰胺柱分离纯化,将流出液稀释至30%-40%甲醇含量,再次用第二根聚酰胺柱分离纯化,用40%-50%甲醇洗脱第二根聚酰胺柱,将洗脱液再次用第三根聚酰胺柱分离纯化,用80%-90%甲醇洗脱聚酰胺柱,洗脱液旋干,获得纯度为40%的光甘草定,加入20%-30%甲醇水重结晶,获得纯度98%的光甘草定。最终,40%光甘草定的产率在4%-5%,98%光甘草定的产率在0.5%-1%。最后通过结构修饰,改善其水溶性,先将溴乙酸甲酯(1 mmol),光甘草(0.1 mmol),K2CO3(0.2 mmol)一起加入到丙酮溶液中,60℃下搅拌反应8-10 h,反应结束后用水和乙酸乙酯萃取,拌样过硅胶柱,乙酸乙酯:石油醚(1:10,1:6,1:4)梯度洗脱,分出白色油状固体。将产物加入适量甲醇溶解,加入大量水,KOH(0.6 mmol),45℃-60℃,反应2-3小时,反应结束后蒸发掉甲醇,加入水,调酸成弱酸性(1 mol/L稀盐酸),乙酸乙酯萃取,旋干有机层为所需物质。