研究背景与目的食管癌（Esophageal cancer）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,是全球第六大癌症死亡原因。食管癌的高发病率和高死亡率以致其成为全球癌症死亡和负担的主要原因之一。早期准确诊断食管癌对患者的生存和改善不同分期食管癌的治疗选择具有重要意义。饱和脂肪酸被视为多种癌症的危险因素。然而,迄今为止的证据并不能充分的证明他们如何准确地促进癌症发展,仍需要大量研究来证明。代谢组学可以从人体代谢产物揭示肿瘤的存在和机制,可被用于表征扰动的代谢途径并鉴定各种癌症中的潜在生物标志物。因此,本研究通过识别食管癌患者血清和粪便中的差异代谢物,探讨了差异代谢物在食管癌发展和转移中的作用和机制,为食管癌差异代谢物作为肿瘤早期的预测生物标志物提供研究基础。研究方法1.收集淮安地区经病理确诊的食管癌病例23例,按照年龄与性别1:1配对,匹配无消化系统病史的健康对照23例,收集食管癌病例与健康对照人群血清和粪便样品,应用高分辨串联质谱系统检测血清和粪便中的代谢物。2.利用二元logistic回归模型分别分析粪便和血清中差异代谢物对食管癌的预测和诊断价值。3.收集淮安地区经病理确诊的食管癌病例88例,选择无消化系统病史的健康对照44例,应用高分辨串联质谱系统,对粪便和血清样本中月桂酸进行靶向定量检测。4.应用qRT-PCR检测食管癌组织样本和食管癌细胞株中GPR40,GPR84和GPR120的m RNA表达水平。5.利用GPR84 siRNA敲低食管癌细胞株EC109中GPR84的表达,并应用q RT-PCR和Western blot检测GPR84 si RNA在细胞中的敲低效率。在GPR84 si RNA转染的EC109细胞中观察月桂酸影响食管癌细胞的生物学功能变化。用Transwell小室来检测其对食管癌细胞迁移和侵袭的影响,并用流式细胞仪检测细胞的凋亡变化与周期分布。6.应用Western Blot检测G（i/o）/PI3K/AKT通路中相关蛋白的表达水平。研究结果一、食管癌的粪便和血清的差异代谢组高分辨串联质谱系统检测血清和粪便中的代谢物,发现食管癌患者血清代谢物和粪便代谢物中涉及多种代谢物和代谢通路的改变,并且一些代谢物在粪便和血清中表现出不同的代谢改变。1.食管癌的粪便差异代谢组共筛选出182种差异代谢物。在食管癌组,γ-亚麻酸、3,4-Dihydroxyphenylpropanoa te、鞘氨醇、9（S）-HODE、高香草酸、月桂酸（Lauric acid,Dodecanoic acid,LA）等多种物质在粪便代谢组中表现下调,反式肉桂酸（trans-Cinnamic acid）、链甾醇（Desmo sterol）、5-Methoxyindoleacetate等表现上调。3,4-Dihydroxyphenylpropanoate和月桂酸被纳入和构建二元logistic回归模型,可以用来预测食管癌的发病风险,而其余则没有预测意义。基于模型预测食管癌发病风险的预测概率绘制ROC曲线,该曲线下面积为0.941（95%CI,87.6%-100%）。2.食管癌的血清差异代谢组共筛选出159种差异代谢物。在食管癌组中PC（18:1（9Z）/0:0）[U]、甘氨胆酸（Glycocholic Acid）、鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic Acid）、PS（18:0/18:1（9Z））、反式肉桂酸（trans-Cinnamic acid）、5-Methoxyindoleacetate等多种物质在血清代谢组中表现下调,月桂酸、鞘氨醇（Sphinganine）、PC（20:5（5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）/20:4（5Z,8Z,11Z,14Z））、（2’E,4’Z,7’Z,8E）-Colnelenic acid等表现上调。月桂酸被纳入和构建二元logistic回归模型,可以用来预测食管癌的发病风险。基于模型的预测食管癌发病风险的预测概率绘制ROC曲线,该曲线下面积为1.0（95%CI,100%-100%）。二、月桂酸在人群样本中的靶向检测和定量分析1.食管癌患者与健康人群粪便中月桂酸的定量检测根据实际标准品浓度和峰面积绘制标准曲线,线性回归方程为y=540.7x+118.55,线性回归系数R~2为0.9954。（信噪比S/N=2:1）检测限为0.03μg/L,线性范围为0.06-15.625μg/L。结果发现食管癌患者粪便（0.24±0.60μg/L）中月桂酸浓度与健康对照组（0.30±0.60μg/L）相比,差异无统计学意义。2.食管癌患者与健康人群血清中月桂酸的定量检测食管癌患者血清（0.95±0.99μg/L）中月桂酸浓度显著高于健康对照组（0.50±0.61μg/L）,差异具有统计学意义。粪便和血清中月桂酸关联性分析发现,二者呈现正相关关系（r=0.73,P<0.01）。二元logistic回归模型发现血清中月桂酸的浓度对于食管癌的预测能力具有较高的预测特异性。血清中月桂酸的水平与食管癌的患病风险正相关,是其危险因素之一（OR=1.71,95%CI:1.05-2.79,P<0.05）。这表明检测血清中月桂酸水平的变化,对于食管癌的预防有重要意义。三、GPR84在食管癌细胞中表达及其与食管癌细胞生物学功能改变之间的联系1.GPR40,GPR84和GPR120在食管癌组织中的表达情况分析在线数据库中（TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/genes）检索GPR40,GPR84和GPR120基因在人食管组织中的表达情况。与癌旁组织相比,食管癌组织中GPR84和GPR120基因高表达,分别为1.9和1.7倍,差异有统计学意义,而GPR40差异无统计学意义。在我们的食管癌组织样本中,根据q RT-PCR结果,与癌旁组织相比,GPR84在癌组织中表达升高2.4倍,而GPR120的表达则没有统计学意义,说明GPR84可能参与了食管癌的发展。2.月桂酸影响食管癌细胞的生物学功能分析（1）建立GPR84 knockdown的EC109细胞株采用表达GPR84 knockdown的3条si RNA转染EC109细胞株,用q PCR在基因水平检测GPR84的表达,结果发现,经过si RNA转染后,3条si RNA序列均下调细胞中GPR84水平,分别下调为原来水平的22%、14%和8%。选择抑制效率最高的si RNA-3序列用于建立GPR84 knockdown EC109细胞株。选用si RNA-3转染细胞,采用Western blot在蛋白水平检测GPR84的表达,细胞中GPR84在m RNA和蛋白水平均下调。（2）应用CCK8实验检测月桂酸对食管癌细胞增殖的影响用含有不同浓度月桂酸（LA）的培养基（0μM,10μM,50μM,100μM,200μM）培养EC109细胞,分别在24h、48h、72h利用CCK8细胞增殖实验检测月桂酸对细胞的影响,发现随着作用时间和作用浓度的增加,月桂酸可以促进109细胞的增殖,其中最佳作用时间和作用浓度分别为72h和100μM。设置四个实验组:NC si RNA组,NC si RNA+LA组,GPR84 si RNA组,GPR84 si RNA+LA组。应用100μM月桂酸（LA）作用于上述实验组,利用CCK8实验检测细胞的增殖能力。发现GPR84 si RNA抑制了100μM LA诱导的EC109细胞增殖,单独的GPR84 si RNA对EC109细胞增殖没有影响。（3）利用Transwell小室检测EC109细胞的迁移能力。结果发现,NC si RNA组迁移数目为（133.60±6.73）,NC si RNA+LA组为（201.6±19.65）,GPR84 si RNA组为（144.8±7.46）,GPR84 si RNA+LA组为（138.8±18.61）。与NC si RNA组相比,NC si RNA+LA组差异有统计学意义。与GPR84 si RNA+LA组相比,NC si RNA+LA组也具有显著差异。单独的GPR84 si RNA对EC109细胞迁移没有影响。在LA的存在下,GPR84 si RNA抑制了100μM LA诱导的EC109细胞迁移,说明LA通过GPR84促进了EC109细胞迁移。（4）利用Transwell小室检测EC109细胞的侵袭能力。发现NC si RNA组侵袭数目为（64.0±4.30）,NC si RNA+LA组为（85.4±2.41）,GPR84 si RNA组为（65.2±2.68）,GPR84 si RNA+LA组为（65.0±4.53）。与NC si RNA组相比,NC si RNA+LA组差异有统计学意义。与GPR84 si RNA+LA组相比,NC-Si RNA+LA组也具有显著差异。单独的GPR84 si RNA对EC109细胞侵袭没有影响。在LA的存在下,GPR84 si RNA抑制了100μM LA诱导的EC109细胞侵袭,说明LA通过GPR84促进了EC109细胞侵袭。（5）用流式细胞仪检测EC109细胞的凋亡。结果发现,NC si RNA组凋亡率为（8.79±0.11）%,NC si RNA+LA组为（4.40±0.08）%,GPR84 si RNA组为（8.43±0.30）%,GPR84 si RNA+LA组为（8.56±0.18）%。与NC si RNA组相比,NC si RNA+LA组差异有统计学意义。与GPR84 si RNA+LA组相比,NC si RNA+LA组也具有显著差异。在GPR84的存在下,LA的处理抑制了EC109的细胞凋亡。说明月桂酸（LA）通过GPR84抑制食管癌109细胞的细胞凋亡。（6）应用流式细胞仪检测EC109细胞的细胞周期改变。NC si RNA组周期分布为G1期（57.26±1.07）%,S期（30.33±0.83）%,G2期（12.41±0.54）%,NC si RNA+LA组为G1期（56.44±0.84）%,S期（31.87±0.89）%,G2期（11.69±0.24）%,GPR84 si RNA组周期分布为G1期（60.77±6.17）%,S期（26.72±3.14）%,G2期（12.51±3.05）%,GPR84 si RNA+LA组为G1期（56.64±1.57）%,S期（29.51±3.05）%,G2期（13.86±1.51）%。统计学分析发现组间周期分布差异无统计学意义（P>0.05）,即尚可认为GPR84knockdown和LA均对细胞周期没有影响。四、月桂酸通过GPR84调控食管癌细胞生物学功能改变的机制研究（1）应用Western blot检测PI3K-AKT通路相关蛋白表达水平,包括Akt和p-Akt蛋白水平。结果发现NC si RNA+LA组Akt磷酸化水平显著升高,PI3K-AKT通路被激活。（2）应用Western blot检测PI3K-AKT通路的下游蛋白MMP-9的表达水平。结果显示,NC si RNA+LA组MMP-9蛋白表达水平显著升高,说明月桂酸通过GPR84受体激活PI3K-AKT通络,活化的Akt通过磷酸化作用激活其下游靶蛋白MMP-9,使基底膜和细胞外基质降解,破坏癌细胞迁移侵袭的组织学屏障,从而促进食管癌细胞迁移侵袭。（3）用Western blot检测PI3K/AKT/Bcl-2/Bax通路靶蛋白Bcl-2以及Bax的表达水平。结果发现,NC si RNA+LA组Bcl-2蛋白表达水平显著增加,Bax表达显著降低。细胞内Bcl-2表达增加,活化的Akt通过磷酸化作用激活Bcl-2的表达,Bcl-2和Bax的异源二聚体增加,凋亡趋势减弱,抑制细胞凋亡。（4）应用Western blot检测PI3K-AKT通路下游靶蛋白Caspase9表达水平。结果显示,NC si RNA+LA组Caspase9蛋白表达水平显著降低,说明月桂酸通过GPR84受体激活PI3K-AKT通络,继而使Caspase9蛋白失活,抑制了食管癌细胞的凋亡。研究结论1.食管癌进展过程中的代谢紊乱主要以脂肪酸代谢为主,作为饱和中链脂肪酸的月桂酸在血清和粪便中差异变化,可能与食管癌的发生发展有关。2.食管癌患者血清中月桂酸浓度显著高于健康人群,并且与粪便中月桂酸浓度呈正相关。3.中链脂肪酸的特异性受体GPR84在食管癌组织和细胞中特异性高表达,月桂酸可能通过GPR84调控食管癌细胞生物学功能改变。4.月桂酸通过GPR84促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡。5.月桂酸可以通过激活PI3K-AKT通路并作用于其下游靶蛋白MMP-9促进细胞侵袭迁移,并作用于Caspase9、Bcl-2和Bax蛋白,发挥抑制凋亡的作用。