血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病，我国现行的防治策略不能有效地控制该病的流行，迫切需要研究并提出新的防治技术。为此，血吸虫病疫苗研究备受关注。围绕这一主题，本博士后工作主要集中在从技术策略上探索提高血吸虫疫苗免疫保护力的可能途径，如构建粘膜免疫用疫苗；构建血吸虫抗原表位和乙型肝炎核心抗原融合的家蚕表达转移载体；开展多价疫苗研究等。同时，开展日本血吸虫基因表达谱的研究，为寻找新的具有免疫保护作用的疫苗候选分子提供基础。具体研究工作如下。1．Sj．28GST抗原表位与CTB融合基因构建、表达及其免疫效果研究霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit，CTB)是良好的免疫佐剂和载体蛋白，本实验首先构建了可表达CTB的原核表达质粒，并同Sj．28GST抗原表位融合表达，检测该种粘膜疫苗的免疫保护效果。为了在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚单位，将ctb基因片段转入Novagen公司的原核表达质粒pET-30a(+)，并在3’端融合表达六个His，构建重组表达质粒pET-CTB。将表达质粒pET-CTB转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白以包涵体形式表达，分子量大小约为14KD。重组蛋白变性后利用His柱进行纯化。Western印记检测重组蛋白能够被抗CT抗体所识别，具有较好的抗原性。ELISA实验显示重组蛋白能与神经节苷脂结合，表明其具有CTB的生物学活性。为了构建含有编码CTB和日本血吸虫Sj．28kdGST抗原表位核苷酸序列的原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达，分析Sj．28GST的表位分布，合成了Sj．28GST的4个抗原表位簇，再将它们同CTB亚单位基因融合，得到了编码四个Sj．28GST抗原表位及CTB的重组基因。转化大肠杆菌BL21(DE3)表达，对重组蛋白进行western分析，表明重组菌株表达了CTB和SJ．28GST表位蛋白，表达产物以包涵体形式存在。将实验鼠分为10组，每组10只，包括rSJ．28GST、rCTB和rSj．28GST+rCTB、rCTB-Sj．28GST灌胃免疫组，以及rSj．28GST、rCTB、rCTB-Sj．28GST和rSj．28GST+rCTB皮下免疫组，PBS灌胃及皮下对照组。在第4次免疫后1周，经腹部感染日本血吸虫尾蚴40±1条，45d后解剖观察减虫率和减卵率。结果，rCTB-Sj．28GST灌胃及皮下免疫组减虫率分别为28.6％及17.7％，每克肝减卵率分别为46.3％及21.3％。用表达产物经口服免疫小鼠后，所产生的对日本血吸虫的免疫保护力明显高于用单独的重组Sj．28GST免疫的小鼠所产生的免疫力，所表达的融合蛋白中CTB可能起到了免疫佐剂的作用，增强了SJ．28GST的免疫原性。2．日本血吸虫抱雌沟蛋白编码基因的克隆与诱导表达条件的研究日本血吸虫抱雌沟蛋白编码基因(Gynecophoral canal protein，GCP)是雄虫差异表达，同血吸虫雌雄虫合抱、雌虫发育、成熟、产卵相关的基因。本文于该序列开放阅读框两端设计引物并分别引入XholⅠ和HindⅢ两个酶切位点，以原有的SjGCP／pGME-T为模板，用PCR法扩增出目的基因片段。再用双酶切法克隆入表达载体pGEX-6p-1。比较不同浓度IPTG诱导剂、不同诱导表达温度和诱导表达时间等对融合蛋白表达的影响。结果：用PCR法扩增出目的基因片段约1950bp，开放阅读框长1932 bp，编码643个氨差酸，理论分子量为62KDa。DNA序列分析显示，与已报道Sj．GCP序列相同。重组质粒SjGCP／pGEX-6p-1高效表达融合蛋白，但在0.01mmol／L-2.0 mmol／L的IPTG浓度、15℃-37℃诱导表达温度和0.5-16小时诱导表达时间范围内，rSjGCP／pGEX都以不溶性包涵体形式表达。遂采用分离、洗涤、变性溶解的方法，结合分子筛层析和亲和层析，对重组融合蛋白包涵体进行了纯化。同时，构建了Sj．GCP的核酸疫苗pcMV-Sj．GCP，测序表明，和实验构想一致。3．日本血吸虫多价疫苗的研制和免疫效果评估多价疫苗是否具有协同免疫保护作用，观察三种重组的日本血吸虫抗原蛋白：28KDa谷胱甘肽S转移酶rSj．28GST(glutathione S transferase，Sj．28GST)、日本血吸虫23KDa膜蛋白大亲水端(23kDa membrane protein large hydrophilic domain，LHD-Sj23)、rSjGCP及三种核酸疫苗组合(VR1012-Sj．28GST，VR1012-LHD-Sj23，pcMV-rSjGCP)免疫小鼠诱导的抗血吸虫的保护性免疫效果，探索日本血吸虫重组抗原rSj．28GST的优选免疫次数。将小鼠分为13组，每组10只，分别用不同的疫苗免疫，重组蛋白以佐剂206作为佐剂。同时设PBS和佐剂206对照组。最后一次免疫后，每鼠攻击40±1条日本血吸虫尾蚴，42天剖杀。结果，各免疫组回收虫体数均有下降，从6％到39％不等，肝脏虫卵计数显示，各免疫组虫卵数也均有所下降，减卵率从24.0％-47％不等，其中以DNA混合疫苗组减虫和减卵幅度最大，分别为减虫率39％(P＜0.05)，减卵率47％(P＜0.05)。三价疫苗免疫小鼠和二价或单价疫苗一样，都能诱导产生对血吸虫攻击感染的部分免疫保护力，但未见明显提高免疫保护力。用重组的Sj．28GST一次、二次、三次免疫动物，都可诱导显著的保护效果，三次免疫获得的保护效果略高于一次、二次免疫组，但差异不显著。4．家蚕表达日本血吸虫保护性抗原表位和乙型肝炎核心抗原融合蛋白的研究。乙肝核心抗原(HBcAg)具有很强的免疫原性，可用来增强自身免疫原性不强的外源抗原决定簇的免疫作用，本文利用PCR技术扩增出人乙肝核心抗原(HBcAg)全基因，构建含HBcAg基因的质粒；通过突变的方法，使得HBcAg的免疫优势区c／el80-81位含有SalI酶切位点，以便融合其他的外源基因。构建含突变的HBcAg基因的家蚕表达转移载体pBacPAK-His-HbcAg；分析Sj．23kd膜蛋白基因、Sj．GCP以及Sj．28GST基因的抗原表位基因，利用PCR技术扩增这些抗原表位核苷酸序列，通过粘末端连接的方法，将它们分别与HBcAg的免疫优势区c／el 80-81位融合，构建家蚕表达转移载体。测序分析，这些抗原表位核苷酸序列同HBcAg基因融合，得到了3个含日本血吸虫抗原表位并融合HBcAg基因的家蚕表达转移载体，为利用HbcAg作为免疫载体蛋白研制抗血吸虫病疫苗提供了基础。5．血吸虫性别发育过程中的基因表达谱分析为获得新的血吸虫疫苗候选分子，对本课题组利用血吸虫雌雄虫cDNA消减文库中的cDNA克隆制备的cDNA芯片进行杂交，研究分析血吸虫雄雌虫发育过程中基因表达谱的变化。芯片质量分析显示，在对数据进行均一化处理后，试验所采用的芯片杂交方法有较好的重复性和一致性。分析结果表明，该芯片3082个克隆中有2474个呈现雌、雄虫差异表达。其中雄虫高表达1102个，雌虫高表达1372个。这些差异表达基因在血吸虫不同发育阶段虫体上也呈现不同表达水平。雌、雄虫高表达的基因分析表明，雄虫高表达的基因在14天到17天就出现变化，雌虫高表达的基因则大都在20天到24天之间发生变化。测序的1117个cDNA片段分属562个不同基因。其中有206个在雄虫中高表达，256个在雌虫中高表达，100个在雌雄虫中mRNA水平相当。芯片聚类分析获得了一些表达时相一致的基因和不同时间高表达的基因。用荧光定量RT-PCR对芯片杂交的可靠性进行验证，显示芯片结果可信、准确。正在对数据进行进一步挖掘，从基因的功能、参与的生物学过程以及细胞组成等方面发现了解发育过程中的现象。为寻找诱导高免疫保护作用的血吸虫候选疫苗抗原以及了解血吸虫发育生物学提供数据和基础。