陆地棉黄萎病抗病基因的挖掘及功能鉴定

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:houguangyun1981
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棉花是世界上重要的经济作物,黄萎病是一种土传真菌病害,俗称“棉花的癌症”,会造成棉花产量减少和纤维品质下降。但是,目前对黄萎病的遗传机制尚不清楚,已挖掘到的可应用于育种的抗黄萎病基因较少。本研究以314份陆地棉资源材料为实验材料,以强致病力的大丽轮枝菌Vd592为供试菌株。根据6个田间环境、4个温室环境的表型鉴定结果及最佳无偏估计值(BLUP)组成11个抗病性表型数据,依据抗病性鉴定结果筛选抗黄萎病的陆地棉资源材料;其次,通过高通量全基因组关联分析与RNA-seq技术共定位快速、准确挖掘新的陆地棉抗黄萎病主效位点,筛选出抗病基因的候选区间;最后,选择参与黄萎病抗性的候选基因,并利用基因沉默技术、转基因技术等方法进行候选基因的功能鉴定。主要结果如下:1.314份陆地棉核心种质抗黄萎病鉴定与优异种质筛选(1)对3年2点获取的314份陆地棉资源材料各性状数据进行相关性统计分析,结果表明:相对病情指数与株高、有效铃数、皮棉和衣分呈现显著性负相关;(2)供试核心种质资源遗传变异丰富,各表型性状受环境影响较大,有利于抗病表型性状优异等位基因位点的挖掘;(3)1990年之后育成的品种抗病性优于1970-1990年及1970年之前育成的品种;(4)我国黄河流域育成品种的整体抗性优于其他植棉区品种的抗性;(5)314份陆地棉资源材料中没有免疫的品种,高抗品种有1个,筛选出47份抗病品种,占总体供试材料的14.90%;(6)来源于国外的材料共计40份,表现为耐病和感病,其中,表现为耐病17份,占比42.5%,表现为感病23份,占比57.4%,结果表明,来自国外的材料抗性水平较低。2.多组学共定位鉴定棉花抗黄萎病基因(1)通过全基因组关联分析技术鉴定出122832个SNP,密度为每千碱基3.23个SNP,变体数量大约为3-104个。曼哈顿结果显示:染色体A02、A05、A06、A10、A11、D05、D07、D10、D11和D12中存在显著相关信号,A11染色体可以在GLM、MLM、CMLM三种经典模型中被重复检测,表明A11(A11_113830848-117065952)是一个主要的相关信号,包含18.7%的相关SNP。(2)在A11_117249761-A11_119855924和A11_113830848-A11_117065952区间内共筛选到382个基因和152个基因,获得2个与棉花抗黄萎病相关的显著性位点,分别是A11_119011344和A11_116221642,均位于A11染色体上。(3)通过GO富集和KEGG通路富集,初步选择参与植物与病原菌相互作用的89个基因,比对转录组表达量数据存在37个基因在抗病材料中植棉2号不同时间段的根部组织中存在显著差异表达,并且呈现高表达的趋势;针对这个结果进一步验证,得到4个与棉花黄萎病抗性相关的基因,并进行基因克隆。根据基因差异表达分析结果,选取GhA11G373600和GhA11G352200作为候选基因,并分别命名为GhNFYB8和GhDUSP12。3.GhNFYB8和GhDUSP12在棉花中的功能鉴定首先,将GhNFYB8和GhDUSP12分别在中植棉2号和新陆早36号0h、2h、12h、36h、48h、72h、120h(接菌处理后取样)的根部组织中进行荧光定量差异表达实验,结果显示:在抗病材料中植棉2号中,表现为先上升再下降的趋势,并且在48h时达到最大值,后呈现下降趋势;其次,对GhNFYB8和GhDUSP12进行VIGS功能鉴定,发现沉默目的基因后植株叶片出现萎蔫、变黄甚至脱落,而空载对照植株生长相对健康,植株白化表型、沉默效率检测、病情指数调查、大丽轮枝菌定量及病原菌恢复等实验也验证到目的基因不参与表达后,中植棉2号对大丽轮枝菌表现更加敏感。结果表明:GhNFYB8和GhDUSP12基因参与植株对抗大丽轮枝菌侵染的免疫过程。4.GhNFYB8和GhDUSP12在拟南芥中的功能鉴定在拟南芥中过表达GhNFYB8和GhDUSP12,通过在营养土中对其T2代植株进行表型鉴定,目前获得T2代阳性种子。
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