动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）是心脑血管疾病共同的病理基础,严重危害人类健康。高甘油三酯血症是As相关心脑血管疾病发生的独立危险因素,探讨如何降低血浆中甘油三酯（triglyceride,TG）水平及其调控机制对As防治具有重要意义。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase,LPL）作为水解TG的关键限速酶,由平滑肌细胞、心肌细胞等实质细胞分泌后进入血管腔,锚定于内皮细胞血管腔面,水解乳糜微粒（chylomicrons,CM）、极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）等富含甘油三酯脂蛋白（triglyceride-rich lipoproteins,TRLs）中的TG。如何有效促进LPL水解TG成为抗As发生发展的关键策略。2008年,Kumar等通过对胰岛素抵抗小鼠的研究首次发现一类定位于染色体9p13.3上的能量平衡基因Encho编码,含76个氨基酸残基的分泌性蛋白adropin,此蛋白可调节脂质代谢,改善胰岛素抵抗,增加胰岛素敏感性,并发现体内TG代谢水平可影响血浆中adropin的浓度。同时,有研究证实adropin可上调罗非鱼肝细胞中LPL的表达,但其具体机制未明。以上研究提示adropin可能通过调控LPL参与血浆TG代谢,影响As的发生发展。因此,深入研究adropin的调控机制有望为As及相关心血管疾病的防治提供新的靶标和思路。随着基因表达调控研究的不断深入,以基因组修饰为研究内容,而不改变基因组碱基序列的表观遗传学方式已成为基因表达调控的新策略。我们通过预实验发现,As小鼠模型血浆中adropin水平明显降低,而adropin启动子区域组蛋白去乙酰化水平则显著升高,但其具体机制尚不清楚。因此,进一步明确组蛋白去乙酰化对adropin的调控作用将为As的防治提供新视角。已有研究证实组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDACs）家族中的HDAC11是催化基因组蛋白去乙酰化的关键酶,主要是对组蛋白的H3K14位点进行去乙酰化修饰。继而我们推测HDAC11通过催化adropin启动子区域组蛋白去乙酰化,而调控adropin的表达。长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子,通过多种机制调控组蛋白修饰、DNA甲基化或染色质重构,使基因沉默或激活,参与心血管疾病的发生发展。其中反义lncRNAs（NATs,Natural antisense transcripts）是经编码或非编码基因的反义链转录形成的lncRNAs,可通过特殊的二级结构与编码基因进行互补配对,抑制翻译等过程,发挥负向调控基因表达的作用。我们采用生物信息学分析发现,lncRNA HDAC11-AS1和HDAC11定位于同一染色体上（3q25）,且转录方向相反,提示lncRNA HDAC11-AS1是HDAC11的天然反义转录物（NATs）。在预实验中,我们构建lncRNA HDAC11-AS1慢病毒过表达载体并转染至人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells,HA-VSMCs）后发现HDAC11表达明显下调,由此,我们推测lncRNA HDAC11-AS1可负性调控HDAC11;而过表达或沉默HDAC11后检测结果显示HA-VSMCs中HDAC11与adropin表达正性相关。综合以上文献、生物信息学预测分析及预实验结果,我们提出:“HDAC11促进adropin组蛋白去乙酰化;lncRNA HDAC11-AS1靶向沉默HDAC11,降低adropin组蛋白去乙酰化水平,导致adropin表达上调,促进血浆LPL表达,降低TG水平,抗As”的研究假说。为此,本研究设计了四部分实验来论证此假说。首先,以HA-VSMCs为实验对象,过表达或沉默HDAC11,检测adropin组蛋白去乙酰化水平及adropin表达情况。接着,过表达或沉默细胞lncRNA HDAC11-AS1,观测HDAC11表达与活性、adropin组蛋白去乙酰化水平及adropin表达;同时过表达HDAC11和lncRNA HDAC11-AS1,观察上述指标。其次,过表达或沉默HA-VSMCs中adropin,检测LPL表达,并探求其具体机制。最后,高脂饮食喂养的apoE^-/-小鼠,尾静脉分别注射构建的HDAC11和lncRNA HDAC11-AS1慢病毒载体,检测对小鼠主动脉adropin组蛋白去乙酰化水平、adropin和LPL表达、血脂水平及主动脉As斑块的影响。本研究有望从表观遗传学视角揭示adropin组蛋白去乙酰化对adropin表达以及脂质代谢的影响,阐明lncRNA HDAC11-AS1靶向沉默HDAC11,降低adropin组蛋白去乙酰化水平,上调adropin表达,从而使LPL表达增加,减低血浆TG水平的作用机制,以期为As防治提供新的干预途径和药物作用靶点。第一部分Adropin组蛋白去乙酰化对adropin表达的影响目的:观察过表达或沉默HA-VSMCs的HDAC11后,adropin组蛋白去乙酰化水平、adropin表达变化;明确HDAC11对adropin组蛋白去乙酰化的影响。方法:1.转染HDAC11和shHDAC11进入HA-VSMCs,实时定量PCR、Western blot检测HDAC11的表达水平;2.将HDAC11和shHDAC11转染进入HA-VSMCs,实时定量PCR、Western blot检测细胞内adropin的表达水平。3.转染HDAC11和shHDAC11进入HA-VSMCs,采用Western blot观察adropin组蛋白H3K14的去乙酰化水平。结果:1.实时定量PCR、Western blot检测结果显示转染HDAC11可显著增加HDAC11的表达;在细胞中转染shHDAC11可抑制HDAC11;2.实时定量PCR、Western blot实验结果显示转染HDAC11可显著降低adropin的表达,在细胞中转染shHDAC11可上调adropin表达;3.Western blot实验显示转染HDAC11组adropin组蛋白乙酰化的H3K14明显减少（说明组蛋白去乙酰化水平增加）,转染shHDAC11组adropin组蛋白乙酰化的H3K14明显增加（说明组蛋白去乙酰化水平降低）。小结:1.HDAC11增加HA-VSMCs内adropin组蛋白去乙酰化水平;2.HDAC11可抑制HA-VSMCs内adropin表达。第二部分lncRNA HDAC11-AS1对adropin组蛋白去乙酰化的影响及调控机制目的:以HA-VSMCs为实验对象,过表达或沉默lncRNA HDAC11-AS1,检测细胞中HDAC11表达水平,adropin组蛋白去乙酰化水平、adropin表达,揭示lncRNA HDAC11-AS1对HDAC11和adropin组蛋白去乙酰化的影响。方法:1.利用在线生物信息学分析lncRNA HDAC11-AS1和HDAC11之间的关系;2.沉默或过表达HA-VSMCs的lncRNA HDAC11-AS1,采用实时定量PCR、Western blot检测细胞中HDAC11的表达水平;3.沉默或过表达HA-VSMCs的lncRNA HDAC11-AS1,通过Western blot实验检测adropin启动子区域乙酰化组蛋白H3K14的表达水平;4.沉默或过表达HA-VSMCs的lncRNA HDAC11-AS1,采用实时定量PCR、Western blot检测adropin mRNA和蛋白表达水平。结果:1.生物信息学分析发现,lncRNA HDAC11-AS1和HDAC11定位于同一染色体上（3q25）,且转录方向相反,lncRNA HDAC11-AS1是HDAC11的天然反义转录物（NATs）;2.实时定量PCR、Western blot检测显示沉默HA-VSMCs中的lncRNA HDAC11-AS1,HDAC11 mRNA水平和蛋白水平明显升高,过表达lncRNA HDAC11-AS1后,HDAC11 mRNA水平和蛋白水平明显降低;3.Western blot实验结果显示沉默HA-VSMCs中的lncRNA HDAC11-AS1,adropin启动子区域组蛋白去乙酰化水平明显升高,过表达lncRNA HDAC11-AS1后,adropin启动子区域组蛋白去乙酰化水平明显降低;4.实时定量PCR、Western blot检测结果显示沉默HA-VSMCs中的lncRNA HDAC11-AS1,adropin mRNA水平和蛋白水平明显降低,过表达lncRNA HDAC11-AS1后,adropin mRNA水平和蛋白水平明显升高;5.Western blot实验结果显示过表达HDAC11组adropin启动子区域组蛋白去乙酰化水平明显升高,过表达HDAC11同时转染lncRNA HDAC11-AS1慢病毒过表达载体组可明显逆转该现象。小结:1.lncRNA HDAC11-AS1是HDAC11的天然反义转录物,抑制HDAC11的表达;2.lncRNA HDAC11-AS1通过HDAC11抑制adropin组蛋白去乙酰化水平,使adropin表达增加。第三部分Adropin调节LPL表达及其分子机制目的:过表达或沉默adropin,检测细胞中LPL表达水平及相关信号通路,旨在揭示adropin对LPL的影响及其具体机制。方法:1.分别过表达或沉默adropin,实时定量PCR、Western blot检测LPL的表达水平;2.使用一种AMPK特异性抑制剂WZ4003,并与adropin共同处理HA-VSMCs;用实时定量PCR、Western blot检测LPL的mRNA和蛋白表达水平。3.用Western blot检测adropin对AMPK蛋白表达及其磷酸化水平的影响。结果:1.实时定量PCR、Western blot检测结果显示过表达adropin可显著增加LPL,沉默adropin可抑制LPL;2.实时定量PCR、Western blot检测发现过表达adropin组可显著增加LPL水平,加入AMPK特异性抑制剂WZ4003后,可逆转adropin升高LPL的作用;3.Western blot检测显示adropin组AMPK磷酸化水平升高,沉默adropin组AMPK磷酸化水平则明显降低,提示adropin主要是通过影响AMPK活性来调控LPL。小结:1.adropin可上调LPL表达;2.adropin通过AMPK通路促进LPL表达。第四部分lncRNA HDAC11-AS1对apoE^-/-小鼠As的影响及其机制目的:观察apoE^-/-小鼠As病变形成、主动脉窦As病变和斑块脂质蓄积、主动脉adropin和LPL表达以及血脂等方面的变化,探求lncRNA HDAC11-AS1对apoE^-/-小鼠As的影响。方法:1.8周龄雄性apoE^-/-小鼠为实验对象,以高脂饮食喂养复制动脉粥样硬化动脉模型,通过尾静脉注射lncRNA HDAC11-AS1过表达慢病毒载体或HDAC11;2.10周后,apoE^-/-小鼠予以过量麻醉处死后,取血待用,用4%的多聚甲醛溶液进行心脏灌流,观察主动脉弓及其三个分支（头臂干、左颈总动脉、左锁骨下动脉）动脉粥样斑块形成情况;3.将apoE^-/-小鼠分离好的主动脉分别从主动脉根部和髂总动脉处剪断,纵向剖开,用油红O染色来显示主动脉血管壁脂质蓄积情况;4.快速冰冻切片技术将各组apoE^-/-小鼠主动脉窦组织切片,进行HE染色后观察主动脉窦斑块面积,利用ImagePro Plus图像分析软件检测;5.各组apoE^-/-小鼠主动脉窦切片采用油红O染色,观察主动脉窦切片As病变脂质蓄积的情况,用ImagePro Plus图像分析软件计算病变面积与管腔面面积的比值;6.各组apoE^-/-小鼠主动脉窦切片采用Masson染色,观察主动脉窦As病变的胶原纤维含量;7.用ELISA法检测lncRNA HDAC11-AS1对各组apoE^-/-小鼠血液中adropin和LPL含量的影响;8.全自动生化分析仪检测各组apoE^-/-小鼠血清TG、TC、FFA的水平。结果:1.在体视显微镜下发现HDAC11组apoE^-/-小鼠主动脉弓及三个分支白色As病灶面积较其他三组而言最为广泛,lncRNA HDAC11-AS1组白色斑块较其他三组而言最少,lncRNA HDAC11-AS1+HDAC11组白色斑块较HDAC11组明显减少;2.油红O染色结果显示HDAC11组主动脉内膜油红O染色阳性区域占血管内表面总面积的比率最高;与HDAC11组比较,lncRNA HDAC11-AS1组主动脉内膜油红O染色阳性区域占血管内表面总面积的比率最少;HDAC11+lncRNA HDAC11-AS1组主动脉内膜油红O染色阳性区域占血管内表面总面积的比率较HDAC11组减少,提示HDAC11会增加apoE^-/-小鼠主动脉血管壁脂质蓄积,促进As病变的发生,而lncRNA HDAC11-AS1可逆转此现象,减少As病变;3.HE染色结果发现HDAC11组主动脉窦病变面积与管腔面积比值最大;对比HDAC11组,lncRNA HDAC11-AS1组主动脉窦病变面积与管腔面积比值最低;HDAC11+lncRNA HDAC11-AS1组主动脉窦病变面积与管腔面积比值较HDAC11组也有所减少;4.结果发现,HDAC11组主动脉窦油红O红染区域占管腔面积的比值最大;与HDAC11组比较,lncRNA HDAC11-AS1组主动脉窦油红O红染区域占管腔面积的比值最少;HDAC11+lncRNA HDAC11-AS1组主动脉内膜油红O红染区域占管腔面积的比值较HDAC11组减少。提示HDAC11会增加apo E^-/-小鼠主动脉窦As病变处脂质蓄积,而lncRNA HDAC11-AS1可逆转此现象,减少As病变脂质蓄积;5.Masson染色结果显示,HDAC11组主动脉窦As病变的胶原纤维含量最多;与HDAC11组比较,lncRNA HDAC11-AS1组主动脉窦As病变的胶原纤维含量明显减少;HDAC11+lncRNA HDAC11-AS1组主动脉窦As病变的胶原纤维含量较HDAC11组减少;6.ELISA实验结果显示,与HDAC11组比较,shHDAC11组和lncRNA HDAC11-AS1组血液中adropin和LPL含量明显增加;HDAC11+lncRNA HDAC11-AS1组血液中adropin和LPL含量较HDAC11组增加,提示lncRNA HDAC11-AS1促进小鼠体内adropin和LPL表达增加;7.全自动生化分析仪检测结果显示,与HDAC11组比较,shHDAC11组、lncRNA HDAC11-AS1组、HDAC11+lncRNA HDAC11-AS1组血液中TG、TC含量减少,FFA含量增加。小结:1.lncRNA HDAC11-AS1抑制apoE^-/-小鼠As病变的发生发展。2.lncRNA HDAC11-AS1抑制apoE^-/-小鼠As斑块内的脂质蓄积、血浆脂质水平。结论1.HDAC11增加HA-VSMCs内adropin组蛋白去乙酰化水平,进而抑制adropin表达;2.Lnc RNA HDAC11-AS1通过HDAC11抑制adropin组蛋白去乙酰化水平,使adropin表达增加;3.Adropin通过AMPK通路促进LPL表达;4.Lnc RNA HDAC11-AS1抑制apoE^-/-小鼠As斑块内的脂质蓄积、血浆脂质水平,延缓As病变的发生发展。