内蒙古手工奶酪是我国的民族传统奶酪。分布广阔的内蒙古草原造成手工奶酪产地气候和原料乳不同,进而影响奶酪微生物对内蒙古奶酪的发酵质量。同时,为了迎合非蒙古族人民的口味,在原始的内蒙古手工奶酪中加入蔗糖成为流行的贩卖方式,但该添加蔗糖方式是否改变内蒙古手工奶酪的微生物群落结构多样性和安全性、营养成分和风味物质种类的影响尚未可知。本研究选取来自内蒙古不同草原(呼伦贝尔草原、科尔沁草原、鄂尔多斯草原、锡林郭勒草原和乌兰察布草原)的共11个零添加或蔗糖添加的手工奶酪样品作为研究对象,结合高通量测序技术、基础理化性质分析,以及挥发性成分和游离氨基酸的检测,研究内蒙古不同草原手工奶酪的微生物群落结构的多样性,以及微生物对手工奶酪的营养成分和风味形成的影响与功能。同时比较分析蔗糖添加与否的供试内蒙古手工奶酪微生物群落结构、奶酪基础理化性质、挥发性成分和游离氨基酸类型,探究蔗糖添加对奶酪微生物群落多样性和安全性、以及奶酪营养成分和风味物质的影响。最后,基于全基因组测序技术探究一株来源于蔗糖添加手工奶酪的栖热菌(Thermus CEJ2-1S1),解析其在奶酪产酸发酵过程中的代谢途径和发挥作用。主要研究结果如下:1.内蒙古手工奶酪微生物群落结构差异。构建了深度充足的高通量测序文库。来源于内蒙古中部乌兰察布草原和锡林郭勒草原的手工奶酪样品具有普遍低于来源于东、西部呼伦贝尔、科尔沁和鄂尔多斯草原手工奶酪样品的OTU数量和Chao1指数,且所有零添加手工奶酪样品具有显著低于添加蔗糖手工奶酪样品的OTU数量和Chao1指数。基于Weighted Unifrac距离的UPGMA和PCoA分析表明,来源于内蒙古中部的乌兰察布草原和锡林郭勒草原的所有手工奶酪样品微生物群落结构能明显地不同于来源于东、西部呼伦贝尔、科尔沁和鄂尔多斯草原的所有奶酪样品。同时,所有零添加手工奶酪样品具有明显区分于其它添加蔗糖样品的微生物群落结构。2.内蒙古手工奶酪微生物类群。物种注释结果表明,源于中部乌兰察布和锡林郭勒草原的手工奶酪样品中乳酸菌类菌群的优势性(相对丰度86.6%~98.6%),普遍高于源自内蒙古东、西部呼伦贝尔、科尔沁和鄂尔多斯草原奶酪样品(相对丰度37.9%~84.4%)。所有零添加手工奶酪的发酵剂微生物类群均以乳球菌属(Lactococcus)为绝对优势菌群(相对丰度73.8%~87.9%)。而添加蔗糖的手工奶酪样品主要以链球菌(Streptococcus)为发酵剂微生物中最优势菌群(相对丰度25.8%~84.0%)。同时,非发酵剂微生物菌群中的一些特殊类群比例明显的增加,例如鄂尔多斯EJ2样品中占据12.3%相对丰度的栖热菌(Thermus)这类非致病性的菌属,以及科尔沁KJ样品中占8.7%的不动杆菌(Acinetobacter)、呼伦贝尔HJ中占1.9%的肠球菌(Enterococcus)、鄂尔多斯EJ1中占2.5%的拟杆菌属(Bacteroides)等条件致病菌属。3.微生物对内蒙古手工奶酪基础理化性质与营养物质的功能。供试内蒙古手工奶酪的水分含量、pH、NaCl、脂肪、蛋白质、乳糖和蔗糖含量均未随着草原地域的分布而呈现出特殊规律性。然而,添加蔗糖的内蒙古手工奶酪的水分含量、pH、乳糖和蔗糖的含量均普遍高于零添加样品;而脂肪和蛋白质含量则普遍低于零添加奶酪样品。同时,Spearman相关性分析显示上述理化因子与测序文库中的OTU数量和Chao 1物种丰度指数存在显著的相关性。4.微生物对内蒙古手工奶酪风味物质的功能。供试奶酪样品中总共检测到13种酸,19种烃,17种醇,10种醛,11种酮,22种酯,2种呋喃,5种烯烃,和2种吡嗪类挥发性成分。这些挥发性成分没有随着奶酪来源的草原地域分布而呈现出一定的规律性,但是主成分分析结果显示零添加和蔗糖添加的内蒙古手工奶酪具有明显区分的挥发性成分组成。其中,零添加手工奶酪样品较蔗糖添加样品普遍具有更高相对含量的酸类、呋喃类、烯烃类和吡嗪类挥发性成分,以及更低相对含量的酯类挥发性成分。同时,确定了其中29种挥发性成分与24个微生物菌属具有相关系数>0.6的较高正相关性。除了12种挥发性成分与5种乳酸菌类细菌具有正相关性外,其余所有挥发性成分均与非发酵剂微生物具有正相关性。同时,鄂尔多斯EJ1和EJ2,锡林郭勒XS1和XJ1中检测到14种游离氨基酸的结果表明,不同来源的手工奶酪添加蔗糖后可能形成与零添加样品不同的、独特类型的游离氨基酸组成。5.内蒙古手工奶酪栖热菌的分离与功能解析。分离培养并全基因组测序鄂尔多斯EJ2样品中的Thermus CEJ2-1S1菌株。KEGG注释结果显示该菌株可以分解代谢乳糖,经EMP途径产生中间产物丙酮酸,丙酮酸进入乳酸代谢途径、乙酸代谢途径、丙酸代谢途径和三羧酸循环代谢途径,产生乳酸、乙酸、丙酸,以及琥珀酸、苹果酸、富马酸等有机酸。牛奶直投发酵试验验证了Thermus CEJ2-1S1可以在70℃条件下产生上述有机酸。其产生的最高浓度的柠檬酸可能作为碳源底物提供给乳杆菌MXS11-1S4等发酵剂乳酸菌用于发酵代谢过程。根据上述这些结果,推测内蒙古手工奶酪添加的蔗糖取代乳糖成为奶酪微生物主要利用的糖原,从而导致奶酪微生物群落中发酵剂乳酸菌含量的下降,减弱其发酵奶酪酸化的程度,进而促进了非发酵剂微生物菌群的生长繁殖,导致条件性致病菌菌群优势性增加,并严重消耗原料奶中的脂肪和蛋白质,产生更为丰富和特殊的挥发性成分和游离氨基酸,最终导致内蒙古手工奶酪营养成分和风味发生明显的的改变。而分离自鄂尔多斯EJ2样品中的Thermus属菌株可能拥有类似于乳酸菌的代谢途径,产生多种有机酸而降低奶酪pH,为乳酸菌发酵提供充足的柠檬酸底物,扮演辅助产酸发酵的角色。