背景及目的：结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是我国常见多发的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势。放疗目前已成为结直肠癌综合治疗的重要组成部分,而如何从众多患者中筛选出可放疗获益的“个体化治疗”病人,继而增加患者的放射敏感性、提高肿瘤学效果具有现实意义。MicroRNA (miRNA)是长度约为21-25核苷酸的内源性非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3-非翻译区(3’-Untranslated Region,3’-UTR)完全或不完全匹配结合来将其降解或抑制其翻译,发挥转录后调节作用。其中microRNA-221(miR-221)是新近发现的一种miRNA,其过表达能增强肿瘤细胞的侵袭能力,与肿瘤的发生发展关系密切；P57kip2属于激酶抑制蛋白CIP/KIP基因家族,可使细胞增殖停滞于G0/G1期,从而发挥对细胞周期的负性调控作用。P57kip2是miRNA-221的靶基因之一,miRNA-221可以通过抑制p57kip2表达促进结直肠癌细胞增殖,但对在放射应激状态下miR-221和p57kip2基因的表达变化规律知之甚少,miR-221调节p57kip2表达继而对结直肠癌细胞放射敏感性的影响亦未见相关报道。本研究旨在观察不同X射线照射剂量(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)下,结直肠癌Caco2细胞中miR-221和p57kip2的mRNA及蛋白的表达变化以及两者的相关关系。利用反义寡聚核苷酸技术抑制细胞中miR-221基因的表达,细胞克隆形成实验检测Caco2细胞在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射剂量下的细胞存活分数(SF)和增殖性死亡的增殖比,初步探讨miR-221反义寡聚核苷酸(AS-miR-221)能否发挥结直肠癌放射增敏作用及其机制。实验方法：(1)常规体外培养结直肠癌Caco2细胞系,用不同剂量X射线(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)进行照射(采用美国瓦里安600直线加速器6MV X线进行一次性照射,辐射时培养板上加盖2cm厚有机玻璃板使细胞处在剂量建成区下相对均匀区,源皮距为100cm,剂量率为3.2Gy/min),24小时后提取细胞总RNA和蛋白质,采用Real-Time Q-PCR检测细胞中miR-221和p57kip2mRNA的表达水平,Western-blot检测p57kiP2蛋白的表达水平,了解结直肠癌细胞在放射治疗的应激状态下miR-221及其调控靶基因p57kip2的表达变化规律,初步评价miR-221/p57kip2信号通路在结直肠癌放疗中的作用及临床意义。(2)利用LipofectamineTM转染反义miR-221(AS-miR-221)序列,同时设置空白对照组及阴性对照组,利用Real-Time Q-PCR和Western-blot技术检测干扰后miR-221和p57kip2基因的表达情况；利用克隆形成实验计算各实验组细胞在不同照射剂量下的存活分数和增殖性死亡的增敏比,同时单击多靶模型拟合计算出三组细胞的平均致死剂量D0值和准域剂量Dq值,评价抑制miR-221基因表达后对Caco2细胞放射敏感性的影响；继而预先转染p57干扰siRNA (p57-siRNA),再经AS-miR-221转染,将AS-miR-221联合p57-siRNA转染的Caco2细胞(设立p57-NC siRNA为阴性对照组)在中位剂量4Gy下进行照射,通过克隆形成实验计算细胞的存活分数,与AS-miR-221组进行对照,初步评价抑制miR-221的表达对Caco2细胞放射敏感性影响的机制。(3)实验所得数据均用均数±标准差表示,采用完全随机设计的单因素方差分析和析因设计的方差分析,多个样本均数间的两两比较采用Student-Newman-Keuls (S-N-K)检验,以P<0.05为差异具有统计学意义,所用操作均用SPSS13.0统计软件完成。实验结果：1.在不同剂量X射线照射下miR-221及p57kip2基因的表达变化所有样本中miR-221及p57kip2cDNA显示指数增长,并达到平台期,其扩增曲线均为一组典型的倒S型曲线,扩增效率较高；通过设置复孔取平均值,即得到各样本中目的基因扩增的Ct值作为miR-221及p57kip2定量判定。四种人CRC细胞系HT-29、Lovo、SW-480、Caco2中miR-221表达量分别为2.29±0.21、1.12±0.14、1.93±0.22、0.54±0.14,与正常对照HUVEC相比(0.12±0.04),差异具有统计学意义(P<0.01)。我们选取miR-221基线表达水平适中的Caco2细胞系作为进一步研究对象。在0-8Gy照射剂量范围内,Caco2细胞中miR-221的表达水平随着放射剂量的增加而升高(P<0.01)；p57kip2mRNA的表达水平则无明显变化(P>0.05),但其蛋白表达水平随着放射剂量的增加而逐渐降低(P<0.01)。2.反义microRNA-221(AS-miR-221)对结直肠癌细胞放射敏感性的影响以脂质体转染miR-221反义寡聚核苷酸(AS-miR-221),应用实时荧光定量PCR (Real-time Q-PCR)检测转染前后Caco2细胞中miR-221的表达水平,-2-△△CT法计算各组细胞目的基因的确切含量。AS-miR-221转染组miR-221的表达量为0.38±0.07,显著低于空白组及阴性对照组(1±0.06和1.17±0.14,P<0.01),证明转染效果良好。细胞克隆形成实验显示AS-miR-221转染组在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射剂量下的细胞存活分数(SF)分别为(53.83±1.23)%、(29.04±1.50)%、(9.06±0.54)%、(3.61±0.14)%,对照组和转染无义序列组在2Gy照射剂量下的SF分别为(84.24±0.72)%、(80.84±0.82)%,4Gy时为(68.38±0.71)%、(65.47±1.22)%,6Gy时为(35.73±0.73)%、(36.22±0.78)%,8Gy时为(19.22±0.74)%、(18.45±0.35)%。随着照射剂量的增加,AS-miR-221转染组的细胞死亡数目较其余两组明显增加(F=264.47,P<0.01),说明AS-miR-221转染对Caco2细胞确实有明显的放射增敏作用。采用单击多靶模型拟合计算出实验中空白照射组、转染无义序列照射组、转染AS-miR-221照射组的平均致死剂量D0值分别为1.42、1.52、0.94,准域剂量Dq值分别为2.91、2.77、1.81,转染AS-miR-221照射组的D0和Dq值均明显小于空白照射组及转染无义序列照射组,亦说明转染AS-miR-221组细胞的放射敏感性明显高于其余两组。为验证转染AS-miR-221对结直肠癌细胞的增敏作用是否通过调节p57kip2的表达介导的,我们检测各组细胞中p57kip2基因的表达情况。AS-miR-221转染组中p57kip2mRNA的表达量为1.17±0.12,转染无义序列组和空白对照组分别为1.22±0.19及1±0.17,各组间p57kip2mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)；Western-blot显示AS-miR-221转染组p57kip2蛋白的灰度值为1885.56±13.21,明显高于转染无义序列组和空白对照组(分别为959.64±8.64及823.68±7.98,P<0.05)。各组间p57kip2mRNA的表达水平无明显变化,但p57kip2蛋白表达水平有明显差异,说明miR-221对P57kip2的调控是在转录后水平。继而Caco2细胞预先给予或不给予p57-siRNA处理24h后,再经AS-miR-221转染,24h后Real-Time Q-PCR和Western-blot分别检测细胞中p57kip2mRNA和蛋白质的表达水平,结果显示p57-siRNA可以显著抑制Caco2细胞中p57kip2mRNA和蛋白质表达,证明行siRNA干扰效果确切；将包括AS-miR-221联合p57-siRNA转染在内的各组细胞在中位剂量4Gy下进行照射,通过细胞克隆形成实验计算各组细胞的存活分数,AS-miR-221联合p57-siRNA转染组与AS-miR-221组相比差异具有统计学意义(SF分别为47.91%±1.37%和29.04%±1.50%,P<0.05)。实验结论1.Caco2细胞系在不同照射剂量下(0～8Gy), miR-221表达水平随着照射剂量的增加而升高,而p57kip2mRNA表达水平则无明显变化,但其蛋白表达水平随着放射剂量的增加而逐渐降低。X线照射在上调结直肠癌细胞中miR-221表达的同时,可通过转录后调控机制下调p57kip2蛋白的表达水平,且两者在一定范围内呈剂量依赖性关系。2. AS-miR-221可通过转录后调节来上调p57kip2蛋白的表达,并发挥对Caco2细胞的放射增敏作用,且此增敏效应可被p57kip2特异性拮抗剂anti-p57-siRNA所绝大部分(但不能完全)消除,这一方面说明AS-miR-221对Caco2细胞的放射增敏作用的确由p57kip2所介导；而另一方面亦说明AS-miR-221除了上调p57kip2表达外,尚具有其他p57kip2非依赖性抗肿瘤生物学功能。这与目前有关miRNA的最新认识相一致,即miRNA与其靶mRNA并不是简单的“一对一”直接线性关系,而是构成复杂的网络调控模式。