背景:银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病,遗传、感染、免疫紊乱等因素均与本病发生有关,其典型临床表现为散在分布的境界清楚的红色斑块,上覆银白色鳞屑,易反复发作,给患者带来极大的心理和经济负担。近年来免疫学机制研究发现,T细胞主导的免疫微环境紊乱是银屑病发病的主要原因。然而,中性粒细胞穿梭出血管散在浸润于真皮,并进一步被趋化迁移到表皮形成Munro或Kogoj微脓疡,是银屑病早期或脓疱型银屑病的典型病理表现之一。多项临床研究指出,粒细胞-单核细胞吸附血浆分离置换疗法能够有效缓解泛发型脓疱型银屑病(GPP)和关节型银屑病患者的全身症状,证实中性粒细胞在银屑病发病过程中扮演重要角色。但是,中性粒细胞在银屑病发病机制中的作用尚有较多未知。中性粒细胞是人体内最丰富的免疫细胞,是驱动固有免疫反应抵抗病原体的关键,在多种疾病中起着至关重要的作用,包括感染、自身免疫性疾病、肿瘤性疾病和慢性炎症性疾病等。除了经典的吞噬微生物的作用外,中性粒细胞可以通过分泌IL-1α、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ和CXCL8等重要细胞因子促进炎症进展。另外,中性粒细胞释放的多种抗菌肽(AMPs)如S100A8/S100A9、cathelicidin(LL-37)和lipocalin2(LCN2)等,能够调节并放大炎症反应。近年来研究发现,被激活的中性粒细胞可以通过形成胞外诱捕网(NETs)捕获并杀灭病原体。NETs是以自身DNA和组蛋白作为主体的网状结构,附着并暴露多种中性粒细胞颗粒蛋白,包括各种酶类及抗菌肽等。因此,中性粒细胞虽生存期短于其他免疫细胞,但其释放的NETs能够代替中性粒细胞持续参与炎症进展。例如,NETs与多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病和小血管血管炎(SVV)等的疾病进展及相关器官损伤密切相关。另外,中性粒细胞外泌体(exosomes)是其发挥免疫功能的另一种方式。外泌体是细胞外纳米级的膜状小囊泡,能够转移蛋白质、mRNA和microRNAs等,可作为细胞间交流和转运的重要介质。中性粒细胞外泌体能够独立于细胞外,参与多种炎症和肿瘤进展,然而其是否介导银屑病的免疫炎症反应尚不清楚。我们课题组前期研究发现,在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病样小鼠体内清除中性粒细胞后,小鼠皮损的银屑病样炎症明显减轻。基因表达谱芯片分析结果显示,银屑病患者外周血的中性粒细胞存在显著的活化。基于此,我们提出本课题的研究假说:银屑病患者中性粒细胞活化并产生NETs或外泌体等,激活角质形成细胞(KCs)免疫活性,促进多种炎症因子的释放,参与银屑病的发生发展。目的:1.探讨中性粒细胞在银屑病免疫微环境紊乱中的作用,明确中性粒细胞发挥免疫调节作用的主要方式;2.明确NETs在银屑病炎症发展中的作用及其具体机制;3.鉴定中性粒细胞外泌体并探究其在银屑病炎症中的免疫调节作用及其具体机制。方法:1.银屑病患者及健康人中性粒细胞差异分析:收集寻常型银屑病患者及健康对照外周血,磁珠阳性分选中性粒细胞后体外培养一定时间点,流式细胞术分析中性粒细胞的存活率;利用表达谱芯片技术筛查鉴定患者中性粒细胞高表达的基因,并结合文献确认中性粒细胞可能在银屑病免疫微环境中发挥调节作用的方式;采用实时定量PCR、组织免疫荧光共定位及MPO-DNA复合ELISA等方法确定NETs在银屑病患者皮损和循环的水平。2.中性粒细胞在银屑病样小鼠模型中的作用分析:首先,BALB/c小鼠耳部连续外涂IMQ 7天,构建银屑病样小鼠模型,同时给予中性粒细胞清除抗体及相应同型对照预防性干预,另有一组在清除中性粒细胞后皮下回输鼠源NETs;观察各组小鼠皮损表型,收集小鼠皮损样本后切片H&E染色观察组织病理学特征,免疫荧光检测小鼠皮损局部Ly6G标记的中性粒细胞和CD4~+/CD8~+T细胞浸润情况;另外,荧光定量PCR检测小鼠表皮多种炎症因子mRNA水平等。3.NETs及其下游信号通路在银屑病样小鼠模型中的作用与机制分析:建立IMQ银屑病样小鼠模型,利用皮下注射NETs生成抑制剂或清除NETs网状结构的小分子下调小鼠体内NETs水平;或利用siRNA外涂小鼠耳部皮损降低感受NETs刺激的受体的表达;之后通过H&E染色、免疫组化与荧光、Western Blot、荧光定量PCR等技术对各组间小鼠银屑病样炎症水平进行比较分析。4.NETs调控KCs免疫活性及相关机制分析:提取银屑病患者和健康对照者中性粒细胞来源的NETs,刺激原代培养的KCs;荧光定量PCR检测KCs炎症因子如LCN2等的表达;Western Blot和ELISA检测NETs刺激后KCs分泌的促炎因子的蛋白水平;应用液相质谱法检测银屑病患者中性粒细胞产生的NETs的蛋白组分,分析其重要功能分子;使用多种信号通路的干涉片段转染KCs,验证NETs刺激下KCs细胞中受体及其信号通路激活情况。5.LCN2在银屑病样小鼠模型中的作用分析:建立IMQ银屑病样小鼠模型和K14-VEGF转基因鼠模型,腹腔注射LCN2中和抗体降低体内LCN2蛋白水平;通过H&E染色、免疫组化与荧光、荧光定量PCR等技术对各组小鼠银屑病样炎症水平进行比较分析。6.LCN2对中性粒细胞趋化和活化的作用及机制分析:利用transwell小室模型研究LCN2调控中性粒细胞趋化的作用和机制;利用荧光定量PCR、Western Blot、细胞免疫荧光及ELISA等方法检测LCN2对中性粒细胞的活化作用及相关受体与下游信号通路。7.GPP患者中性粒细胞对KCs的活化作用分析:收集GPP患者及健康对照者外周血,磁珠阳性分选中性粒细胞,建立中性粒细胞与KCs共孵育模型;利用外泌体释放抑制剂GW4869预处理中性粒细胞抑制其外泌体的释放;应用CCK-8及荧光定量PCR等方法检测不同条件处理后,共孵育模型中KCs的增殖及细胞因子的表达与分泌。8.中性粒细胞外泌体对GPP皮损局部无菌性脓疱形成的作用及机制分析:收集GPP患者和健康人的中性粒细胞的培养上清,用超高速离心法提取外泌体;利用透射电镜、Western Blot和粒径分析等方法鉴定外泌体后,将其进行Dil染色并与KCs共培养,细胞免疫荧光观察KCs摄取中性粒细胞外泌体的现象;利用荧光定量PCR、Western Blot、细胞免疫荧光及ELISA等方法检测中性粒细胞外泌体对KCs的活化作用和机制;应用液相质谱法检测外泌体的蛋白组分,分析其重要功能分子。结果:1.银屑病患者中性粒细胞活化并释放NETs:流式细胞术结果显示,在体外培养不同时间点后,银屑病患者中性粒细胞的存活率低于健康对照;中性粒细胞基因表达谱芯片结果表明,银屑病患者的中性粒细胞明显活化,大量基因高表达,聚类分析显示高表达的基因多参与炎症、趋化、固有免疫、受体识别等生物学过程,且多个炎症基因如抗菌肽类及颗粒酶类与NETs的形成相关。2.中性粒细胞通过释放NETs参与IMQ诱导小鼠的银屑病样皮炎发生:首先,中性粒细胞清除可显著减轻IMQ小鼠皮损的红斑和鳞屑;与IMQ小鼠模型相比,中性粒细胞清除小鼠表皮厚度显著变薄,炎症细胞浸润减少;免疫荧光实验提示小鼠皮损浸润的免疫细胞数目明显降低;实时定量PCR发现清除组小鼠皮损中炎症因子如IL-1β和LCN2等的表达降低。当在中性粒细胞清除小鼠皮下回输鼠源NETs后,上述炎症指标均显著回升。3.靶向抑制NETs可缓解IMQ诱导小鼠的银屑病样皮炎:皮下注射NETs生成抑制剂CI-amidine或者降解NETs结构的小分子Dnase I酶,可显著减轻IMQ小鼠背部皮损红斑、鳞屑程度,且小鼠表皮厚度变薄,炎细胞浸润减少,表皮炎症因子表达水平明显降低。4.NETs通过TLR4受体及其下游MyD88/NF-κB p65通路激活KCs的免疫活性:首先,利用实时定量PCR发现NETs可促进KCs多种炎症分子的表达,如细胞因子IL-1β和IL-36γ、趋化因子CXCL1/2/8和CCL20、及抗菌肽LCN2等,其中LCN2表达升高最为明显;之后,实时定量PCR、Western Blot和组织免疫荧光等检测到NETs上调KCs模式识别受体TLR4表达水平,且TLR4在银屑病皮损呈高表达;向KCs转染TLR4及其下游信号分子如MyD88或NF-κB p65 siRNA干涉片段后,NETs的上述作用显著减弱。5.靶向抑制NETs下游信号TLR4/LCN2可显著缓解IMQ诱导的银屑病样皮炎:实时定量PCR、Western Blot、免疫组化及荧光等结果显示,利用外涂siRNA或抑制剂降低IMQ小鼠模型皮损中TLR4的表达水平后;或者腹腔注射LCN2中和抗体降低实验小鼠体内LCN2蛋白水平后,IMQ小鼠银屑病样模型或K14-VEGF转基因小鼠银屑病样模型的皮损炎症均明显减轻,表皮多种炎症因子的表达随之下降,特别是中性粒细胞的浸润明显减少。6.LCN2趋化并活化中性粒细胞:transwell小室趋化实验及实时定量PCR等结果显示,LCN2能够趋化中性粒细胞,且进一步活化其产生多种促炎因子和趋化因子;利用不同信号转导通路的化学抑制剂预处理中性粒细胞证实,LCN2通过激活ERK1/2和p38 MAPK通路趋化并活化中性粒细胞。7.中性粒细胞外泌体激活KCs的免疫活性:中性粒细胞和KCs共培养模型证实,GPP患者外周血中性粒细胞不能促进KCs增殖,但能够刺激后者高表达多种促炎因子及中性粒细胞趋化因子;而经外泌体抑制剂预处理后,中性粒细胞对KCs刺激作用明显降低;Dil染料预染的外泌体可被KCs摄取,并进一步激活KCs高表达多种中性粒细胞趋化因子。8.中性粒细胞外泌体携带多种免疫活性物质促进脓疱型银屑病炎症进展:液相质谱法分析来自脓疱型银屑病及健康对照者的中性粒细胞外泌体发现,患者中性粒细胞外泌体富集更多的颗粒蛋白及多种炎症相关分子如OLFM4;实时定量PCR、Western Blot和ELISA等实验结果证实,OLFM4重组蛋白可以激活KCs分泌中性粒细胞趋化因子,从而趋化并聚集更多的中性粒细胞到达皮损形成表皮内无菌性脓疱,加重GPP患者的表型。结论:通过本课题的研究,我们首次发现银屑病患者中性粒细胞活化并产生NETs,能够激活KCs的TLR4受体及其下游信号通路,促进多种促炎因子和趋化因子的表达与分泌,而表达最高的抗菌肽LCN2能够趋化并活化中性粒细胞,从而形成正反馈炎症环路,加重银屑病皮损局部的炎症。另外,中性粒细胞外泌体能够通过携带多种免疫分子活化KCs表达并分泌炎症因子和中性粒细胞趋化因子,促进无菌性脓疱的形成,加重GPP患者皮损炎症表型。我们的研究明确了中性粒细胞参与银屑病发生发展的作用和相关机制,为今后银屑病的临床治疗提供了新的思路。