本实验室多年来从事华支睾吸虫功能基因组学的研究，成功建立了华支睾吸虫cDNA质粒文库，为深入探讨华支睾吸虫与胆管癌的相互关系打下了基础。基于锌脂蛋白在部分癌症发生发展中的作用，本文从华之睾吸虫成虫cDNA质粒文库中筛选出一个MYND型锌指蛋白(MYND-ZF)基因，深入探讨其结构和功能，以期为华支睾吸虫在胆管癌致病机制的系统研究中奠定一定的基础。　　 研究目的：　　 从华支睾吸虫成虫的cDNA文库中筛选出MYND-ZF基因，通过生物信息学相关分析软件预测MYND型锌指蛋白的结构和功能特征。　　 利用基因工程技术对该基因进行原核克隆、表达，获得重组MYND-ZF蛋白，制备特异性抗体。　　 确定华支睾吸虫MYND-ZF蛋白(CsMYND-ZF)的组织定位，初步推测其可能的生物学功能。　　 研究方法：　　 1 CsMYND-ZF基因生物信息学的分析　　 利用BLASTx方法搜索GenBank中的其他物种同源蛋白序列，从华支睾吸虫成虫的cDNA文库中识别出MYND-ZF基因，并进行多序列的同源性比对，分析该蛋白在进化过程中的规律。利用生物信息学相关软件如SignalP、Motifscan、TargetP、Predictprotein等对MYND-ZF进行结构和功能的分析，对CsMYND-ZF的空间结构和功能进行预测。　　 2 CsMYND-ZF基因的重组、蛋自纯化和免疫特性分析　　 2.1 CsMYND-ZF基因的重组　　 依据目的基因的开放阅读框(ORF)和质粒pET-28a(+)酶切位点特点，通过PCRdesign和DNAClub两个软件设计引物，PCR扩增出MYND-ZF基因，利用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ对PCR产物和空质粒pET-28a(+)双酶切，利用T4连接酶连接。然后PCR、双酶切和测序鉴定重组质粒。　　 2.2 CsMYND-ZF蛋白的表达和纯化　　 将重组质粒pET-28a(+)-CsMYND-ZF转化到大肠杆菌BL21/DE3，在IPTG的诱导下表达融合蛋白His-CsMYND-ZF，经SDS-PAGE鉴定后，利用His柱进行融合蛋白的纯化。　　 2.3重组蛋白CsMYND-ZF的免疫特性分析　　 2.3.1免疫大鼠血清的制备　　 用纯化后的重组蛋白(rCsMYND-ZF)免疫SD大鼠，制备含有抗rCsMYND-ZF抗体的免疫血清，并对大鼠血清进行预吸附。　　 2.3.2感染华支睾吸虫血清的制备　　 从麦穗鱼中收集华支睾吸虫囊蚴，通过灌胃感染SD大鼠，成功后取血，分离的血清于-80C保存备用。　　 2.33检测SD大鼠产生抗体的趋势　　 通过ELISA方法，检测rCsMYND-ZF免疫SD大鼠产生特异性抗体的动态变化。　　 2.3.4 CsMYND-ZF的免疫特性分析　　 利用Western Blotting方法，以rCsMYND-ZF免疫大鼠血清和华支睾吸虫感染病人的血清为一抗，对纯化的rCsMYND-ZF的免疫原性和免疫反应性进行分析。　　 2.3.5 CsMYND-ZF对华之睾吸虫病的诊断价值　　 利用ELISA方法，随机选取30份华支睾吸虫感染者的血清，20份日本血吸虫感染者的血清，14份感染肺吸虫感染者的血清，30份健康人的血清，比较rCsMYND-ZF与成虫粗抗原在诊断上的敏感性，以及与日本血吸虫和肺吸虫感染者血清的交叉反应。　　 3 CsMYND-ZF在华支睾吸虫发育不同时期表达和定位的研究　　 通过提取囊蚴、虫卵及成虫阶段的总RNA，反转录成cDNA，然后以cDNA为模板利用特异引物扩增目的基因，了解目的基因在不同时期的表达情况。以抗rCsMYND-ZF大鼠血清作为一抗，对华支睾吸虫的成虫、囊蚴石蜡组织切片进行蛋白的组织定位。　　 4华支睾吸虫MYND-ZF的真核细胞表达　　 4.1 CsMYND-ZF的真核重组及鉴定　　 从成虫cDNA文库当中扩增目的基因，构建真核表达质粒pEGFP-N1-CsMYND-ZF。经PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。　　 4.2 CsMYND-ZF的真核表达和鉴定　　 通过脂质体法将pEGFP-N1-CsMYND-ZF转染HeLa细胞，利用倒置荧光显微镜观察培养24 h和48 h的表达情况，比较与空载体pEGFP-N1细胞表达的差异。通过RT-PCR检测转染重组质粒pEGFP-N1-CsMYND-ZF的HeLa细胞中CsMYND-ZF基因在mRNA水平的转录情况。利用膜蛋白提取试剂盒提取重组质粒转染的细胞的膜蛋白，以CsMYND-ZF免疫大鼠血清为一抗，二抗为羊抗大鼠IgG-HRP，利用Western Blotting鉴定蛋白水平的表达情况。　　 研究结果：　　 1 CsMYND-ZF基因生物信息学的分析　　 该基因全长1,847bp，Blastx分析其具有完整的开放阅读框(ORF)，ORF为21位开始至第1,460位，起始密码为ATG，终止密码为TAA，编码479个氨基酸。等电点和理论分子量分别是6.35和54.8kDa。PredictProtein预测推测蛋白序列二级结构中β折叠(E)、α螺旋(H)和无规则卷曲(L)的比例分别是4.18％、56.37％、39.46％。拓扑学结构分析该蛋白含有一个跨膜区：S102FPIYTLLYHELLVANLL119，N端位于膜内(i)，C端位于膜外(o)。Motifscan预测推测蛋白可能含有cAMP/cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点。InterProScan显示该蛋白链中aa434～aa470属于MYND型锌指结构域，推测其是锌指蛋白家族中的一员。　　 2 CsMYND-ZF基因克隆、表达及免疫特性分析　　 通过特异性引物从成虫cDNA中扩增出目的基因片段，通过电泳鉴定DNA条带在1,500bp左右。重组原核表达质粒pET-28a(+)-CsMYND-ZF经PCR、双酶切及测序后证实构建成功。含有重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导下表达重组蛋白，经SDS-PAGE证实表达的融合蛋白与理论预测的分子量相符，目的蛋白经亲和层析纯化后获得。　　 ELISA检测大鼠血清中抗体变化的趋势，证实该重组蛋白能够刺激大鼠产生特异性抗体，具有良好的免疫原性。　　 Western Blotting鉴定蛋白免疫特性的结果表明，重组蛋白可分别被免疫大鼠血清、感染华支睾吸虫的人血清识别，进一步证实重组蛋白能够刺激大鼠免疫系统产生相应的特异性抗体，具有免疫原性。同时证实重组蛋白具有免疫反应性，具有一定的免疫学价值。　　 以重组蛋白CsMYND-ZF和成虫粗抗原为包被抗原，应用ELISA方法检测30份华支睾吸虫感染者、20份日本血吸虫感染者和14份肺吸虫感染者血清的总IgG。结果提示，CsMYND-ZF对华支睾吸虫感染者血清的检出率为33.3％；粗抗原的检出率为83.3％，与日本血吸虫和肺吸虫感染者的血清均存在交叉反应。　　 3 CsMYND-ZF在华支睾吸虫发育不同阶段表达和定位的研究　　 提取华支睾吸虫囊蚴、虫卵及成虫的总RNA并反转录成相应的cDNA，采用RT-PCR对CsMYND-ZF编码蛋白在发育不同时期的表达进行分析。结果显示，CsMYND-ZF基因在成虫和囊蚴阶段有表达，在虫卵中没有表达。　　 以制备的抗rCsMYND-ZF大鼠血清为一抗，对华支睾吸虫的成虫、囊蚴石蜡组织切片进行CsMYND-ZF的免疫组织化学定位。结果提示，CsMYND-ZF主要定位在成虫和囊蚴幼虫的体表。　　 4华支睾吸虫MYND-ZF的细胞表达　　 通过上述分子克隆技术将目的基因定向克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中，经PCR、双酶切及测序鉴定证实真核重组质粒构建成功。pEGFP-N1-CsMYND-ZF转染HeLa细胞培养24 h后，在显微镜下可观察到绿色荧光分布于除细胞核以外的胞质中，而48 h后胞质中的荧光减弱，在部分细胞的细胞膜上可见稍强的绿色荧光；而转染空质粒的HeLa细胞在24 h和48 h绿色荧光均匀分布于整个细胞内。经检测，在转染重组质粒的HeLa细胞中CsMYND-ZF基因在mRNA水平和蛋白质水平均有转录和表达。　　 研究结论：　　 1.从华支睾吸虫成虫cDNA文库中识别出了CsMYND-ZF基因，CsMYND-ZF全长1,440个核苷酸，编码479个氨基酸，等电点和理论分子量分别是6.35和54.8kDa。拓扑学结构分析该蛋白含有一个跨膜区：S102FPIYTLLYHELLVANLL119，N端位于膜内(i)，C端位于膜外(o)。含有MYND结构域。　　 2.构建了原核表达载体pET-28a(+)-CsMYND-ZF，大肠杆菌经过IPTG诱导表达出重组融合蛋白，并纯化得到了重组蛋白。ELISA显示rCsMYND-ZF能够刺激大鼠产生特异性抗体。Western Blotting结果表明rCsMYND-ZF具有较强的免疫原性和免疫反应性。但诊断效果不佳。　　 3.RT-PCR结果显示，该基因为阶段性表达的，主要表达在成虫和囊蚴阶段，虫卵阶段不表达。通过免疫组化证实CsMYND-ZF主要定位于华支睾吸虫成虫的卵黄腺及囊蚴的排泄囊。　　 4.Hela细胞证实CsMYND-ZF能够在非宿主的真核细胞中实现表达。