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研究目的探讨女性绝经过渡期早期的衰老机理,在前期临床研究的基础上,通过建立绝经过渡期早期动物模型,从内分泌调控及Caspase依赖型卵巢凋亡通路两个方面,探讨益肾续经汤在绝经过渡期早期延缓卵巢衰老进程的作用机制。理论研究绝经过渡期早期标志女性开始衰老,肝血不足是女性衰老早期的典型特点；衰老速度与肾气的强弱密切相关；瘀血是衰老过程的必然产物,血瘀是加速衰老的重要因素。黎烈荣教授针对绝经过渡期早期女性特殊的生理病理基础,兼顾开始虚损的肝肾二脏,养肝血、补肾精的同时,不忘通血脉,以免瘀血阻滞脉络而加速衰老进程,体现了“既病防变”的治未病思想。从女性的最早期衰老阶段着手,在治疗绝经过渡期早期月经不调的同时,中药干预可延缓女性衰老进程,以期推迟绝经年龄,减少绝经过渡期晚期围绝经期综合征的发生,这正是“未病先防”的具体体现。实验研究研究方法：本实验以绝经过渡期(Menopausal Transition, MT) wistar雌性大鼠为研究对象,选取阴道脱落细胞涂片表现为动情间期延长、动情周期紊乱者纳入实验。以大鼠月龄区分MT早期(10月龄)和MT晚期(11-12月龄)。选取符合MT早期标准的大鼠24只,随机分为MT早期模型组、MT早期治疗组和西药对照组,每组8只；选取符合MT晚期标准的大鼠16只,随机分为MT晚期模型组、MT晚期治疗组,每组8只；另选取4-6月龄大鼠8只,作为青年对照组(青年组)。MT早期模型组、MT晚期模型组、青年组分别给予生理盐水；MT早期治疗组和MT晚期治疗组给予益肾续经汤；西药组予以去氧孕烯炔雌醇水溶液灌胃。各组每日均按1ml/100g灌胃,连续灌胃15天,末次给药24小时后,腹主动脉取血,分离血清,酶联免疫吸附法检测抑制素B (INHB)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)水平；摘取卵巢,以电子天平称取卵巢湿重,将脏器湿重换算成脏器指数。石蜡包埋,常规切片4μm,左侧卵巢切片HE染色用于光镜下观察卵巢形态学表现,免疫组化SP法测定各组大鼠右侧卵巢Fas、Cytc、Caspase-12、Caspase-3的表达。实验结果：1、MT早期模型组INHB水平低于青年组(P<0.01),MT晚期模型组低于MT早期模型组(P<0.01)。MT早期治疗组INHB水平显著高于MT早期模型组(P<0.01)。MT晚期治疗组INHB水平与MT晚期模型组INHB水平差异无显著意义(P>0.05)。西药组与MT早期模型组INHB水平差异无显著性(P>0.05)。2、MT早期模型组FSH水平高于青年组(P<0.01)；MT晚期模型组高于MT早期模型组(P<0.01)。MT早期治疗组FSH水平接近青年组(P>0.05)。西药组FSH水平低于MT早期模型组(P<0.01),但高于青年组(P<0.05)。MT晚期治疗组与MT晚期模型组FSH差异无显著性(P>0.05)3、MT早期模型组E2水平明显高于青年组(P<0.01),MT晚期模型组显著低于青年组(P<0.01)。使用益肾续经汤后,MT早期治疗组E2水平较MT早期模型组明显降低(P<0.01),MT晚期治疗组高于MT晚期模型组(P<0.01)。4、青年组卵巢指数高于MT早期模型组(P<0.01),MT早期模型组高于MT晚期模型组(P<0.01)。MT早期治疗组卵巢指数显著高于MT早期模型组(P<0.05)。MT晚期治疗组卵巢指数虽略高于MT晚期模型组,但差异无显著意义(P>0.05)。西药组与MT早期模型组差异无显著性(P>0.05)。5、光镜下可见,MT早期治疗组和青年组大鼠卵巢内有较多数目的初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡等各级生长发育卵泡,黄体、白体等都可见,卵泡形状规则,体积较大。MT早期模型组和西药组大鼠卵巢皮质内卵泡数目较少,卵泡形状不规则。MT晚期模型组和MT晚期治疗组大鼠卵巢内生长卵泡明显减少,卵泡结构紊乱。6、MT晚期模型组卵巢Fas表达水平显著高于MT早期模型组(P<0.01)；MT早期模型组明显高于青年组(P<0.01)。使用益肾续经汤后,MT早期治疗组较MT早期模型组卵巢Fas表达水平显著降低(P<0.01),MT晚期治疗组与MT晚期模型组差异无显著性(P>0.05)。西药组卵巢Fas表达水平与MT早期模型组差异无显著意义(P>0.05)。7、MT晚期模型组卵巢Caspase-12表达水平显著高于MT早期模型组(P<0.05),MT早期模型组明显高于青年组(P<0.01)。MT早期治疗组卵巢Caspase-12表达水平明显低于MT早期模型组(P<0.05),与青年组水平接近(P>0.05)。MT晚期治疗组亦可降低卵巢Caspase-12表达水平(P<0.05)。西药组与MT早期模型组差异无显著意义(P>0.05)。8、青年组卵巢CytC、Caspase-3表达最低,MT早期模型组高于青年组(P<0.01、P<0.01),MT晚期模型组高于MT早期模型组(P<0.01、P<0.01)。MT早期治疗组卵巢CytC、Caspase-3表达均显著低于MT早期模型组(P<0.01、P<0.05),但高于青年组(P<0.01、P<0.01)。MT晚期治疗组卵巢CytC、Caspase-3表达与MT早期模型组无明显差异(P>0.05、P>0.05)。西药组卵巢CytC、Caspase-3表达低于MT早期模型组,差异无显著性(P>0.05)。9、未给药组全部大鼠卵巢Caspase-3表达与其他凋亡指标的两因素相关分析显示,Caspase-3与Fas(r=0.453,P<0.001)、Caspase-12 (r=0.798, P<0.001)和CytC (r=0.935, P<0.001)均呈显著正相关。结论：导师黎烈荣教授提出在绝经过渡期早期以养肝血、补肾精、通血脉立论,拟定益肾续经汤治疗绝经过渡期早期月经不调,延缓女性衰老进程。本课题在前期临床研究疗效确切的基础上,首次建立绝经过渡期早期模型,为研究者未来从实验角度研究绝经过渡期提供了研究基础。实验研究表明,在MT早期使用益肾续经汤,能够升高INHB水平,增强INHB对FSH的负反馈调节,从而降低FSH水平,可以调节卵泡发育和闭锁交替引起的雌激素波动至正常状态。益肾续经汤通过调整紊乱的激素水平,改善激素效应,使激素作用的靶器官蛋白质合成增加,降低卵巢重量下降速度,对生殖轴具有正向调节作用。益肾续经汤能通过降低三条经典凋亡途径的启动凋亡因子Fas、CytC、Caspase-12的表达,从多靶点降低凋亡启始酶的活化或释放,抑制三条Caspase依赖型链式蛋白酶级联反应,继而降低卵巢Caspase-3蛋白的表达,阻止卵巢Caspase依赖型凋亡通路,延缓卵巢老化进程。