鸡传染性支气管炎((?)Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠状病毒科冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,一直是危害世界养禽业的最重要的疫病之一。目前常见IB的临床型是呼吸型和肾型,且之间免疫原性差异较大,致使现有疫苗免疫效果不够理想。IBV有3个主要结构蛋白：S蛋白、M蛋白和N蛋白。S蛋白是IBV非常重要的一个结构蛋白,转译后分为S1和S2糖蛋白。IBV的S1蛋白一直被认为能激发中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜性有关。S蛋白与宿主细胞膜上的受体结合可能是IBV吸附细胞的前提条件,S1基因的变异,将直接影响到病毒与细胞膜受体的结合。本研究主要对IBV典型毒株呼吸型M41株和肾型Holte株的S1基因利用昆虫细胞表达系统进行了重组表达,试对其的免疫原性、组织膜蛋白亲嗜性及其与宿主细胞黏附情况进行比较分析。本试验主要的研究内容、方法和结果如下：1.根据GenBank中已发布的IBVS1基因,设计并合成了1对特异性引物,采用RT-PCR技术扩增S1基因,并进行克隆和测序。本试验扩增出的Sl基因所用的病毒是将本实验室保存IBV M41株和Holte株在CEK细胞盲传三代后又在SPF鸡胚中繁殖七代的鸡胚尿囊液病毒。测序结果表明,IBV M41和Holte株所克隆的S1基因片段大小分别为1655bp和1654bp。序列比较分析,克隆的IBV M41-S1基因与GenBank中已发布的M41株Sl基因核苷酸同源性为99.52%,氨基酸同源性为99.3%；IBV Holte-S1基因与GenBank中己发布的Holte株S1基因核苷酸同源性为99.76%,氨基酸同源性为99.69%；两种毒株s1基因核苷酸同源性为81.61%,氨基酸同源性为89.86%。2.本试验利用Bac-to-Bac真核表达系统构建了表达两株Sl蛋白的重组杆状病毒。将两株重组杆状病毒分别感染Sf9细胞后,用IFA、SDS-PAGE和Western blot等方法检测Sf9细胞中蛋白的表达。经检测,在Sf9细胞中得到了IBV M41株和Holte株的S1蛋白,蛋白分子量约为64ku。通过分子量大小可知,得到两株病毒的S1蛋白糖基化均不完全,但仍然具有抗原活性。3.将IBVM41株和Holte株重组S1蛋白的细胞裂解液与等体积弗氏完全佐剂充分融合后,分别对1日龄的SPF雏鸡进行免疫,采集免疫后的血清,利用SPF鸡胚进行病毒-血清交叉中和试验。试验结果表明,本试验表达的两株S1蛋白可以诱导抗体产生并有良好的免疫保护力,两株S1蛋白的免疫血清也有一定程度的交叉保护能力。4.本试验首次利用间接ELISA方法验证S1蛋白与不同组织细胞膜蛋白结合情况,初步推断其在体外与各组织细胞膜蛋白的亲嗜性。用提取的4日龄SPF雏鸡的气管、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、十二指肠、法氏囊、胸腺和脾脏等组织细胞膜蛋白包被,用纯化的S1蛋白与其作用,再用IBV阳性血清与HRP标记的羊抗兔IgG检测结合情况。两株S1蛋白分别与肺脏膜蛋白结合差异均极显著,M41株S1蛋白的结合能力高于Holte株；与肾脏、气管和腺胃膜蛋白结合差异显著,其中Holte侏S1蛋白与肾脏及腺胃膜蛋白结合能力高于M41株,而M41株S1蛋白与气管膜蛋白的结合能力高于Holte株；两毒株S1蛋白与法氏囊、肝脏、脾脏、十二指肠、胸腺及心脏膜蛋白结合差异不显著。这说明不同致病性IBV毒株与各组织细胞膜蛋白的结合力存在差异,且该差异可能与IBV的组织嗜性变化有关。5.为研究S1蛋白对宿主细胞的黏附和/或封闭能力,本试验将纯化的S1蛋白与CEK细胞作用后观察IBV对CEK细胞的影响。IBV M41-S1蛋白和IBV Holte-S1蛋白浓度均按0.5μg、0.75μg和1μg对CEK细胞进行处理后再加入IBV观察细胞病变情况。按Reed-Muench两氏法计算得出,IBV M41株和Holte株对CEK细胞的TCID50分别为10-4.423/0.1mL和10-5.234/0.1mL；IBV M41株对处理后的CEK细胞的TCID50分别为10-3.222/0.1mL、10-2.5/0.1mL和10-2.233/0.1mL; IBV Holte株对处理后的CEK细胞的TCID50分别为10-3.783/0.1mL、10-2.738/0.1mL和10-2/0.1mL。结果表明,经S1蛋白处理的CEK细胞获得了抵抗IBV感染的能力,与未经处理的细胞相比,明显降低IBV对CEK细胞的感染能力；并且随着S1蛋白浓度的升高,病毒对CEK细胞的感染能力越低；当s1蛋白浓度为0.75μg和1μg时,病毒感染CEK细胞TCID50的变化不明显。IBV Holte株S1蛋白对CEK细胞的黏附封闭能力较强于M41株S1蛋白。说明S1蛋白可以黏附在细胞表面起到一定的封闭作用,从而抑制IBV感染CEK细胞。