【摘 要】
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恩诺沙星（Enrofloxacin,ENR）是一种兽药专用抗生素,被广泛应用于治疗养殖动物的细菌性疾病。但在兽药临床中常出现使用不规范的情况,因而导致ENR在养殖动物体内残留超标,通过食物链被摄入人体后发生蓄积,当超过一定限度时则会对人体多个系统和器官造成严重损害。虽然目前已有单克隆抗体用于检测,但传统单抗具有不可进化和生产工艺繁琐等缺陷。因此,开发一种基于新型抗体针对ENR的快速检测方法是十分有
【基金项目】
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国家自然科学基金（31372453）“流行性乙型脑炎病毒感染相关宿主miRNA的鉴定与功能分析”； 国家重点研发计划项目（2018YFC1602900）“高适应性重组抗体库的构建、筛选及进化技术研究”；
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恩诺沙星（Enrofloxacin,ENR）是一种兽药专用抗生素,被广泛应用于治疗养殖动物的细菌性疾病。但在兽药临床中常出现使用不规范的情况,因而导致ENR在养殖动物体内残留超标,通过食物链被摄入人体后发生蓄积,当超过一定限度时则会对人体多个系统和器官造成严重损害。虽然目前已有单克隆抗体用于检测,但传统单抗具有不可进化和生产工艺繁琐等缺陷。因此,开发一种基于新型抗体针对ENR的快速检测方法是十分有必要的。目的本研究旨在通过构建大库容量的免疫噬菌体单链抗体库,从中筛选出高特异性的ENR单链抗体,然后利用计算机模拟和定点突变技术对单链抗体进化以提高灵敏度,并以单链抗体突变体为基础,为动物性食品中ENR的残留检测,建立更加准确和高效的新型检测方法。方法1.采用碳二亚胺法将ENR与载体蛋白偶联以制备完全抗原,并利用完全抗原对小鼠进行免疫,采集脾脏组织,通过提取总RNA,反转录c DNA和PCR技术扩增出单链抗体的重链和轻链,然后利用重叠延伸PCR将重链和轻链用Linker连接,组装为单链抗体基因。2.采用噬菌体展示技术将单链抗体基因与噬菌体载体p CANTAB5E连接制备重组载体,经过转化入宿主菌TG1中构建噬菌体抗体库。并对抗体库进行多轮淘选和富集,然后随机挑选单克隆进行噬菌体ELISA鉴定,从中选择阳性株进行基因测序。3.利用同源模建和分子对接技术将单链抗体进行进化。首先将测序结果进行序列比对,选择同源性最高的序列为模板,建立单链抗体同源模型并对模型进行评价。选取理想模型与ENR分子对接,分析其关键作用力,并从中选出具有潜在活性的关键残基进行虚拟突变。随后,将结构优化后突变体与ENR进行分子对接,进一步验证模型突变的可行性。利用定点突变技术突变单链抗体质粒,并利用大肠杆菌表达系统进行表达,最后利用蛋白磁珠进行纯化。4.以单链抗体突变体为基础,建立间接竞争ELISA检测方法,并通过建立标准曲线,交叉反应性分析和回收率实验,综合性评价该方法的灵敏度、特异性和准确性。结果1.通过紫外分光光度法和SDS-PAGE鉴定完全抗原,结果显示偶联前后各物质的最大吸收峰和分子质量均发生改变。使用完全抗原对实验动物免疫后,经血清效价测定,结果为1:12800。提取动物脾脏总RNA片段经鉴定完整且纯度较高。经过反转录和PCR扩增出重链约长400 bp,轻链约长340 bp,连接后的单链抗体约长780 bp。2.构建噬菌体抗体库库容为3.45×105,经过四轮的富集和筛选后,库容量达到2.98×107,总体富集倍数为86.4倍,随机挑选的单克隆噬菌体菌落,经Phage-ELISA鉴定,阳性率达到86.7%,选择其中阳性值最高的一株单克隆噬菌体进行测序,获取相应的氨基酸序列。3.经过验证,同源模建所构建的模型良好,满足分子对接要求。经过分子对接分析:ENR的亲水性的羧基和喹啉上的羰基与单链抗体模型上活性位点的疏水性残基Leu121不匹配。随后,本研究将疏水性残基Leu121突变为亲水性残基Asn,得到与ENR亲和力更强的单链抗体突变体序列,将突变体模型与ENR对接后,结合能力更强,打分值-5.16降至-7.83。单链抗体突变体在大肠杆菌BL21中成功表达,经鉴定得到48 KDa的目的条带,经超声破碎后,单链抗体突变体蛋白具有可溶性,在浓度为20 mmol/L咪唑即可纯化单链抗体突变体。4.以单链抗体突变体为基础建立间接竞争ELISA检测方法,y=-0.2369x+0.7077（R2=0.9725）。IC50为7.53 ng/m L,检测范围(IC20～IC80)为:0.41～138.99 ng/m L。相比于未突变前ENR-Sc Fv的IC50（47.12 ng/m L）,灵敏度提高了6.26倍。与其他抗生素交叉性均低于0.04%,在添加当天的平均回收率为75.81%～98.08%,相对标准偏差为1.61%～7.45%。添加后第三天的平均回收率为75.54%～97.77%,相对标准偏差为2.87%～10.72%。结论本研究成功构建出库容量大的噬菌体单链抗体库,并从中筛选出特异性较高的单链抗体,通过进化获得灵敏度更高的单链抗体突变体,基于突变体建立了具有较高的灵敏度、特异性和准确性的间接竞争ELISA检测方法。这为检测动物性食品中ENR的残留,提供更加准确、快速的检测方法。
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