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目的:利用双侧颈总动脉结扎法建立大鼠血管性痴呆模型(2VO),通过大鼠的水迷宫实验(MWM),计算逃避潜伏时间和目标象限停留时间百分比,以评定各组大鼠的空间记忆功能;选用长时程增强(LTP)方法评价大鼠海马区的突触可塑性;采取组织学观察评定海马区的结构变化,研究醋酸格拉默(GA)对血管性痴呆大鼠的脑保护作用。并进一步对海马区微环境进行研究,通过测定BDNF蛋白含量和基因的变化,以及Th1和Th2炎性细胞因子的合成分泌情况,还有海马区胆碱能系统相关酶Ch AT,VACh T和ACh E的表达水平,探讨GA的神经保护和抗炎机制,为血管性痴呆的治疗提供理论依据。方法:本实验以成年雄性Sprague-Dawley大鼠为研究对象,将其随机分为假手术组、模型组、GA治疗组共3组。应用双侧颈总动脉结扎法制备大鼠血管性痴呆模型。治疗组于建立模型后2周给予GA,将100μg GA溶于250μg PBS,平均分成四份,前两份于第一周前两天各一次,剩下两份为每周一次。各组取材前分别进行水迷宫实验,海马区长时程增强实验;取材后,采用HE染色初步评价海马区的病理结构;选用免疫荧光及免疫组化法观察BDNF、GFAP、Iba-1、Ch AT、VACh T、ACh E的表达情况;采取蛋白电泳检测海马区BDNF蛋白含量;采用RT-PCR检测体内海马区和体外GA刺激单核细胞分泌的BDNF基因的表达;应用Tunnel染色检测海马区神经凋亡情况;运用酶联免疫吸附(ELISA)法检测炎性因子Th1(IFN-g)和Th2(IL-4,IL-10)以及前炎症因子TNF-a和IL-6的表达。结果:1、水迷宫实验结果。假手术组和模型组逃避潜伏时间:第1天分别为52.9±11s,62.2±13s,P>0.05;第2天分别为29.6±9s,61.8±10s,P<0.05;第3天分别为25.8±7s,51.4±8s,P<0.05;第4天分别为14.1±6s,39.6±7s,P<0.05;第5天分别为6.8±5s,38.7±6s,P<0.01。假手术组和模型组目标象限停留时间百分比分别是:60.38±5.82%,31±4.11%,P<0.01。以上均提示双侧颈总动脉结扎造成了明显的空间记忆功能障碍。与模型组相比,治疗组潜伏时间:第3天32.2±7s,P<0.05;第4天17.6±7s,P<0.05;第5天14±6s,P<0.01。治疗组目标象限停留时间百分比47.63±4.09%,P<0.01。以上均提示经GA治疗后,模型组空间记忆障碍明显改善,而且差异有统计学意义(P<0.05,表5,图1)。2、LTP结果。各组兴奋性突触后电位(f EPSP)斜率百分比:假手术组139.33±1.76%,模型组114.33±1.67%,GA治疗组133.33±3.28%。与模型组比较,治疗组大鼠海马区的突触可塑性明显增强,差异有统计学意义(P<0.05,表6,图2)3、通过HE染色观察结果。假手术组未见明显的病理改变,海马细胞排列有序,组织结构完整,组织间隙无异常,细胞核呈圆形或椭圆形,胞浆染色均匀,细胞膜完整。模型组可见明显的细胞缺失,海马神经细胞呈缺血样改变,光镜下可见核固缩或偏位,甚至溶解,胞浆内容物减少,结构疏松,伴有细胞坏死,有炎性细胞的浸润,可见神经细胞坏死,神经元外形不易辨认。GA治疗组细胞缺失明显改善,轻度间质水肿,偶有局部坏死、水肿、胞核固缩和炎细胞浸润等现象,但较模型组相比有明显的减轻(图3)。4、免疫组化观察结果。假手术组海马区脑组织中有大量BDNF的阳性细胞表达,模型组BDNF的阳性细胞数显著减少。与模型组相比,治疗组BDNF的阳性细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光观察结果显示:假手术组海马区脑组织中有大量Ch AT、VACh T、ACh E和少量Iba-1、GFAP的阳性细胞表达,模型组Ch AT、VACh T的阳性细胞数显著减少,Iba-1和GFAP的阳性细胞数显著增加,ACh E荧光强度增强,但细胞层数减少。与模型组相比,GA治疗组Iba-1和GFAP的阳性细胞数明显减少,Ch AT、VACh T阳性细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),而ACh E总的阳性细胞荧光强度变化不明显。(图4、8、10)。5、蛋白电泳的结果显示:假手术组海马区脑组织中有大量BDNF蛋白表达,模型组BDNF的蛋白显著减少。与模型组相比,治疗组BDNF的蛋白量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05,图5)。6、Tunnel结果显示:假手术组海马区未见明显Tunnel阳性细胞,模型组Tunnel细胞明显增多,GA治疗组Tunnel阳性细胞数量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,图10)。7、RT-PCR结果显示:体内实验显示:双侧颈总动脉结扎后BDNF基因的相对表达量明显下调,而GA治疗组BDNF基因的相对表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05,图6)。体外实验显示:从大鼠脾脏提取的单核细胞经GA刺激后,BDNF基因水平表达量上调(P<0.05,图7)。8、ELISA多因子检测结果显示:模型组海马组织IL-6、TNF-α、IFN-γ表达明显升高,IL-4、IL-10明显降低,而GA治疗后能够使IL-6、TNF-α、IFN-γ这些促炎因子的表达水平明显降低,IL-4、IL-10明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,图9)。结论:GA形似MBP,可以广泛的、适度的激活自身反应性T细胞,改善慢性脑缺血脑的病理状态,使血管性痴呆大鼠的认知功能得到明显改善,胆碱能系统的损伤也得以修复。本实验从水迷宫行为学、LTP电生理学以及病理学三个层次研究GA对慢性脑缺血认知功能障碍的治疗作用,结果显示,GA可以明显改善痴呆大鼠的空间记忆功能,改善突触可塑性和海马区的缺血状态。进一步研究显示:GA可以促进BDNF蛋白和基因的表达,同时促使海马区Th1向Th2炎症因子的转化,减轻海马区的慢性炎症状态,包括星型胶质细胞及小胶质细胞的激活,IL-6及TNF-α炎症因子的表达。GA通过对微环境的改善,减少了细胞的凋亡,减轻了海马区胆碱能系统的损伤,最终实现对认知功能障碍的改善作用。