目的:血管内皮细胞是连续被覆在血管内膜的单层细胞,在维持血管内稳态中发挥重要作用。各种有害刺激所引起的氧化应激和炎症反应均可造成血管内皮细胞损伤,血管内皮损伤与动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心血管疾病的发生发展密切相关。研究氧化应激对内皮细胞的损伤机制及通心络的干预作用对血管病的防治具有重要意义。通心络（tongxinluo,TXL）是具有益气活血、通络止痛功效的中药复方制剂,临床上广泛用于动脉粥样硬化、冠心病、中风等心脑血管疾病的防治。近期研究发现,通心络具有改善内皮细胞功能,抑制氧化应激的作用,但其作用机制尚不十分清楚。本实验从两方面进行研究,一方面用亚砷酸钠（NaAsO₂）制备氧化应激模型。研究氧化应激对血管内皮的损伤及通心络的干预作用;另一方面,在细胞水平上研究通心络抗氧化应激及保护血管内皮的分子机制。方法:将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组（NaAsO₂处理）和治疗组（通心络干预组）,模型组和治疗组每天腹腔注射NaAsO₂,3mg/kg/d,共计20天,对照组每天腹腔注射生理盐水,治疗组按0.75 g/kg体重每天灌胃通心络超微粉溶液。20天后取材,将小鼠主动脉分为3部分分别进行石蜡包埋、蛋白提取和RNA提取,石蜡切片用免疫组化染色检测p22、HO-1、CD31和KLF5在血管中的表达,Western blot和Real-time PCR分别检测MCP-1、P22、HO-1、KLF5的表达。体外培养的人脐静脉内皮细胞给予不同浓度的NaAsO₂和通心络处理,Western blot和Real-time PCR分别检测p22、HO-1、CD31、PCNA、AKT、和KLF5的表达。结果1通心络对NaAsO₂引起的血管渗透性增加具有改善作用给亚砷酸钠诱导的氧化应激小鼠下腔静脉注射伊文氏蓝染液30min后,取小鼠胸、腹主动脉观察染料通过内皮屏障向血管组织中的渗透情况。与对照组相比,NaAsO₂组血管呈浅蓝色,说明伊文氏蓝渗透进血管组织,TXL处理组血管蓝染明显减轻。从血管组织提取染料进行比色的结果也表明,通心络组比NaAsO₂组渗透进血管的伊文氏蓝减少。通心络对内皮屏障具有保护作用。2通心络抑制NaAsO₂诱导的血管炎症反应和氧化应激提取蛋白质和RNA,Western blot和Real time-PCR检测结果显示,通心络抑制NaAsO₂对炎症相关基因mcp-1表达的上调,同时反映氧化应激的指标,即HO-1,和p22表达在通心络组比NaAsO₂组明显降低。体外培养人脐静脉内皮细胞,给予不同浓度NaAsO₂刺激24 h后提取蛋白,Western blot检测结果显示,与对照组相比,NaAsO₂组HO-1和p22表达升高且呈剂量依赖性。但p47没有明显变化。当用不同浓度的TXL孵育细胞12 h,再给予NaAsO₂刺激24 h时,p22和HO-1表达明显减少,说明通心络能逆转NaAsO₂诱导的内皮细胞氧化应激反应。我们进一步检查NaAsO₂对ROS产生的影响及TXL的干预作用,结果显示NaAsO₂促进ROS的产生,且呈剂量依赖性;通心络预孵育细胞12 h后,再给与NaAsO₂刺激,结果显示通心络能消除NaAsO₂对ROS产生的诱导作用。3通心络通过促进内皮细胞增殖而减轻NaAsO₂对血管内皮的损伤PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,其表达水平可反映细胞的增殖情况。CD31是血管内皮细胞标志蛋白。内皮细胞用不同浓度NaAsO₂刺激后,PCNA和CD31剂量依赖性表达降低,说明NaAsO₂抑制内皮细胞增殖。预孵育通心络后,CD31和PCNA的表达水平比NaAsO₂组增加且呈剂量依赖性。对小鼠模型主动脉血管免疫组化染色的结果显示,通心络能阻断NaAsO₂对CD31表达的阻抑,防止NaAsO₂对血管内皮完整性的破坏。4通心络阻断NaAsO₂对KLF5表达的上调用不同浓度的NaAsO₂刺激内皮细胞24 h后,收集细胞提取蛋白质和RNA进行Western blot和Real time-PCR,结果显示NaAsO₂剂量依赖性诱导KLF5表达。用不同浓度的通心络预孵育内皮细胞12 h后,再给予NaAsO₂刺激24 h,提取蛋白质和RNA进行Western blot和Real time-PCR。检测结果显示,通心络能逆转NaAsO₂诱导的KLF5表达上调且呈剂量依赖性。从NaAsO₂诱导的小鼠氧化应激模型血管中提取蛋白和RNA,对KLF5进行Western blot和Real time-PCR分析的结果和细胞水平的实验结果相一致。免疫组化也提示,通心络能阻断NaAsO₂对KLF5表达的上调作用。5通心络通过激活AKT信号通路而减轻NaAsO₂诱导的氧化应激损伤为进一步明确通心络减轻NaAsO₂诱导的内皮细胞氧化应激损伤的作用分子机制,将细胞与通心络预孵育12 h后再给予NaAsO₂刺激24 h,提取蛋白质进行Western blot分析结果显示,在通心络预孵的细胞内AKT水平明显升高,通心络预孵育组AKT磷酸化水平也比单纯NaAsO₂处理组增高。说明通心络通过激活AKT信号减轻NaAsO₂引起的氧化应激损伤。结论1通心络对NaAsO₂引起的血管渗透性增加具有改善作用2通心络抑制NaAsO₂诱导的血管炎症反应和氧化应激3通心络通过促进内皮细胞增殖而减轻NaAsO₂对血管内皮的损伤4通心络阻断NaAsO₂对KLF5表达的上调5通心络通过激活AKT信号通路而减轻NaAsO₂诱导的氧化应激损伤