研究背景和目的：　　 乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV，简称乙脑病毒)是流行性乙型脑炎(简称乙脑)的病原体，属于黄病毒属。乙脑是经蚊虫媒介叮咬传播而引起的一种中枢神经系统感染的急性传染病，是对人畜危害较大的一种自然疫源性疾病，并可造成严重的神经系统后遗症。“蚊-动物-蚊”是乙型脑炎病毒在自然循环的基本环节。乙脑在世界许多国家均有流行的报道，我国是高发区，全国除东北北部、青海、新疆、西藏外均有乙脑流行，局部地区有爆发或流行。　　 目前乙脑病毒的检测主要有病毒分离法、血清学方法和分子生物学检测方法等。病毒分离法是金标准方法，但敏感性较差，且操作步骤繁琐复杂，耗时较长。血清学方法操作相对简便、快速，但血清学方法的不足是不能获得病原体的详细生物学信息。分子生物学检测方法因为其敏感、特异并能得到病原体的基因做进一步分析，因此得到广泛应用。PCR方法有多种，各有利弊，因此须根据实际情况选择。2000年日本学者Notomi等发明了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件保温数十分钟，即可完成核酸扩增反应。该方法步骤简单，扩增RNA只要在反应体系中加入逆转录酶，就能完全像DNA基因扩增那样，一步实现RNA扩增；灵敏度高，扩增模板可达几个拷贝；快速、高效扩增，整个扩增反应在不到1h即可完成；高特异性，4条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，可根据是否扩增来判断目标基因的存在与否：结果鉴定简便，可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判定，也可以通过琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察有无特异性梯状条带来判别结果。目前很多实验室已经建立LAMP方法检测病原体，有两个实验室也报道了建立逆转录LAMP(RT-LAMP)方法检测乙脑病毒，表明敏感性和特异性均能达到常规RT-PCR水平，但未见与逆转录实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)比较的报道，而Real-time PCR是目前公认的敏感性最高的PCR方法。　　 蝙蝠是哺乳类中分布最广、数量最多的动物之一，属翼手目，分大蝙蝠亚目和小蝙蝠亚目，全世界约有1107种。除南北极外，蝙蝠在世界各地都有分布，包括在高纬度地区、孤立的岛屿和荒凉的沙漠等，然而大部分种类生活在热带和亚热带地区。迄今为止已在蝙蝠体内分离出80多种病毒，其中一些是人兽共患病病毒，人类一些新病毒传染病的爆发也被证实与蝙蝠有关，如1994年澳大利亚爆发的亨德拉病毒(Hendra virus)感染、1998年马来西亚爆发的尼巴病毒(Nipah virus)感染等。国内外学者也有从蝙蝠体内分离出乙型脑炎病毒的报道，一些种类蝙蝠因栖息地点或觅食等生活习性，如捕食蚊、蝇等，与人类接触密切，因而这些蝙蝠可能在乙脑病毒的保存和扩散中起重要作用。过去两年中，我们已经在我国南方一些省份发现一些种类的蝙蝠可携带乙脑病毒，但研究的内容和范围仍很局限，仍然需要更多的研究和科学证据。　　 为深入研究蝙蝠在传播乙脑病毒中的作用，在本研究中，我们建立了乙脑病毒RT-LAMP检测方法，并与RT-PCR及Real-time RT-PCR检测方法进行了比较，以期为蝙蝠乙脑病毒的快速检测提供一种更为简便的方法。同时，我们继续从海南、广东和湖南省部分地区收集蝙蝠标本，调查蝙蝠携带乙脑病毒的状况。　　 研究方法　　 1.乙脑病毒RT-LA肝检测方法的建立　　 1.1 LAMP引物设计　　 从GeneBank中获得乙脑病毒(strain JaOArS982)E基因区序列，利用在线Primer Explorer version 3.0软件，根据LAMP引物设计的原则，设计RT-LAMP检测方法所用的6条引物，包括内引物(FIP、BIP)，外引物(F3、B3)和环引物(LoopF、Loop B)各1对。　　 1.2乙脑病毒RT-LAMP检测方法反应体系及反应条件　　 根据反应体系优化策略，对Bst DNA聚合酶(8U/μL)、SuperScdptⅢ逆转录酶(200U/μL)、dNTP mix(10mM)、Betaine(5M)、MgCl2(50mM)、6条引物等成分进行优化和调整。　　 依据Tm值，将温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增，从多次重复试验中确定最佳退火温度。　　 1.3乙脑病毒RT-LAMP检测方法特异性测试　　 以登革2型病毒、诺如病毒、EV71病毒、星状病毒、犬五联减毒活疫苗的核酸为阴性对照样品，同时设立提取的乙型脑炎病毒核酸为阳性对照，DEPC-Water为空白对照，检验乙型脑炎RT-LAMP方法的特异性。　　 1.4乙脑病毒RT-LAMP检测方法敏感性测试　　 对定量的乙脑病毒核酸样品，进行10倍系列稀释，分别稀释至1：1×1O1～1：1×108，采用建立的RT-LAMP方法进行检测。　　 1.5乙脑病毒RT-PCR及Real-time RT-PCR平行检测　　 将10倍系列稀释的乙脑病毒核酸样品，平行作RT-PCR及Real-time RT-PCR检测。　　 2.蝙蝠标本的收集与处理　　 2008年7月至2009年8月期间，在海南、广东和湖南省部分地区收集蝙蝠标本，进行编号后，请广州大学生命科学院蝙蝠研究专家吴毅教授进行种类鉴定。采集蝙蝠的地点主要有野外阴湿的山洞和棕榈、椰子树叶丛。通过无菌操作解剖蝙蝠，取脑组织标本，分别保存在含有RNAlater、PBS的冻存管中，采用冰袋泡沫箱，经12小时运输回实验室，放入-80℃保存，待检。　　 3.蝙蝠脑组织乙脑病毒的检测　　 3.1 TaqMan Real-time RT-PCR法检测乙脑病毒　　 ①根据GenBank中发布的JEV非结构蛋白基因NS3基因序列，结合生物信息学分析软件比对分析，参考相关文献资料，遵循引物和探针设计的原则，利用Primer Express Software V3.0软件设计特异性引物和TaqMan探针序列。　　 ②利用TaqMan Real-time RT-PCR-法检测蝙蝠脑组织中的乙脑病毒。　　 3.2 RT-PCR法检测乙脑病毒　　 ①参考GeneBank发表的乙脑病毒基因序列，针对病毒保守基因E基因，遵循引物设计的原则，保证引物的合理性和科学性，设计了一对常规RT-PCR引物。　　 ②利用普通RT-PCR法检测蝙蝠脑组织中的乙脑病毒。　　 3.3 RT-LAMP方法检测蝙蝠脑组织乙脑病毒　　 经Taqman探针法检测乙脑病毒阳性的蝙蝠脑组织样本，用本次研究建立的RT-LAMP方法进行检测，同时做阳性对照。　　 3.4乳鼠接种病毒增殖实验　　 将可疑阳性检测样本和阳性对照样本，接种3日龄的昆明乳鼠脑内进行病毒增殖。发病乳鼠会有拒乳、弓背、抽搐、嗜睡、行走不稳等症状，待发病乳鼠濒临死亡时，无菌解剖取脑组织。若观察一周后，无症状出现，则连续盲传三代，仍未出现发病症状，且经检测后，判为阴性。　　 3.5细胞培养　　 将蝙蝠脑组织研磨液上清接种于已培养好长成单层细胞的BHK-21细胞，加入已配置好的MEM混合液，置于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中培养，观察细胞，根据细胞形态变化和RT-PCR方法检测，判断结果。　　 4.质量控制　　 ①移液枪头、EP管、冻存管、手套等实验耗材均为一次性用品；　　 ②逆转录过程采用的移液枪头、EP管和研磨器用DEPC处理，高温高压消毒，烤干后待用，以去除RNA酶污染；　　 ③RNA的提取，RT-PCR的反应体系的试剂加样均在无菌间生物安全柜进行操作，防止环境中RNA酶的污染；　　 ④操作过程中，全程戴口罩、帽子，勤换手套，防止样本和试剂受到来自操作者携带的RNA酶污染；　　 ⑤实验过程中均设立阳性对照和阴性对照。　　 结论　　 1.本研究建立的乙脑病毒RT-LAMP检测方法特异性强，敏感性高于常规RT-PCR，与SYBR Green Ⅰ Real-time RT-PCR敏感性相同。在检测蝙蝠携带乙脑病毒方面，敏感性低于Traqman探针法Real-time RT-PCR。　　 2.检出湖南地区的普通长翼蝠，广东地区的鼠耳蝠和海南地区的小黄蝠、普通长翼蝠存在乙脑病毒，说明我国某些地区的某些种类蝙蝠在自然状态下可以携带乙脑病毒，但病毒载量较低。