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漆酶(Laccase.EC.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶,广泛分布于真菌特别是白腐菌中。与木质素的降解作用有关,能催化许多化合物的氧化反应,其作用底物比较广泛,包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。漆酶在造纸工业、纺织工业、环境保护、生物资源利用、有毒环境污染物转化和新能源开发等诸多领域具有潜在的应用价值。黑木耳菌是担子菌纲、木耳菌科的一种白腐真菌,能组成型地分泌胞外漆酶。本研究以高漆酶活性的黑木耳(Auricularia auricula)菌种为基因供体,建立并应用基于位点专一重组的漆酶基因筛选系统从高漆酶活性的黑木耳菌种中筛选漆酶基因,进而分别构建其诱导型和组成型表达毕赤酵母载体,并通过电击转化毕赤酵母,获得有效表达漆酶基因的工程菌。主要研究结果如下:1.漆酶高产黑木耳菌株的筛选采用氧化带方法对黑木耳29、黑木耳981菌株进行验证筛选,结果表明两个菌株都可以产生明显的氧化带,其中黑木耳29产漆酶活性略高。采用液体发酵培养基对初筛所获得的黑木耳29、黑木耳981菌株进行发酵培养并测定产酶活性,结果表明,两个黑木耳菌株均有漆酶活性并且酶活高峰期集中在18~22天,产漆酶活性较高的菌株为黑木耳981。2.漆酶基因的筛选与克隆构建了基于位点专一重组的酿酒酵母分泌表达载体pPADα-Rec,应用基于位点专一重组的漆酶基因筛选系统,筛选得到了黑木耳漆酶基因lac1 cDNA。通过PCR方法克隆了黑木耳漆酶基因lac1 DNA;通过PCR方法扩增得到不含有自身信号肽的漆酶基因lac。3.表达载体的构建构建了lac1基因的毕赤酵母诱导型表达载体pPIC-lac1和组成型表达载体pGAPH-lac1。构建了lac基因的毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9-lac和组成型表达载体pGAPHα-lac。4.漆酶基因在毕赤酵母中的表达将所有毕赤酵母表达载体线性化并通过电击转化毕赤酵母。经转化子PCR鉴定得到重组子:GS115-pPIC-lac1;GS115-pPIC9-lac;GS115-pGAPH-lac1;GS115-pGAPHα-lac。SDS-PAGE表明在重组菌株GS115-pPIC9-lac中漆酶基因得到了有效表达,而在其他重组菌株中漆酶基因均未能得到表达。5.发酵液pH对重组漆酶产量的影响将GS115-pPIC9-lac菌株在不同pH发酵液进行诱导表达,测定漆酶活性,确定液体发酵的最适pH为4.0。6. GS115-pPIC9-lac酶学性质分析在最适发酵条件下,GS115-pPIC9-lac分泌表达的漆酶最高酶活为0.149UmL-1。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH值稳定性和热稳定性均较好。