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研究背景和目的:脑卒中（Stroke）具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点,是世界第二大致死性疾病,其中由脑缺血引发的脑卒中是最常见的卒中类型。缺血性脑卒中的治疗以溶栓和血管内手术恢复血流为主。但是这些方法存在着治疗时间窗短暂和有严重并发症的危险,故临床应用受限。虽然缺血性卒中发病机制复杂,但围绕神经元存活是目前国内外探讨脑缺血再灌注损伤防治新手段的焦点。神经元的存活及整个神经系统的功能的维持对线粒体功能完整性依赖极高。线粒体代谢紊乱引发的功能障碍是致使脑细胞凋亡和坏死等一系列事件的起点和早期阶段。线粒体不仅是细胞钙信号传导的枢纽并且内膜上的酶复合物还是维持细胞能量需求和代谢稳态的必要成分,因此对于未来的抗脑卒中新药研发,线粒体靶向药物是最有前景的方向。琥珀酸脱氢酶（SDH）又称线粒体复合物Ⅱ,定位于线粒体内膜并耦合两条氧化磷酸化所必需的途径:三羧酸循环和呼吸链。缺氧诱导SDH活性增加,加快琥珀酸氧化速率,驱动线粒体电子传递链通过复合物Ⅰ处的反向电子传递产生大量的ROS,产生氧化应激损伤。但琥珀酸不仅仅是SDH的底物,也是三羧酸循环中的底物磷酸化及α-酮戊二酸脱氢酶复合物的下游产物,有益于维持细胞结构完整性。本实验室前期研究发现TIGAR通过抑制糖酵解途径能够增加磷酸戊糖通路通量,进而增加胞内NADPH产量并通过谷胱甘肽还原酶产生还原型谷胱甘肽清除ROS,故TIGAR显示出很强的抗氧化作用。在缺氧条件下,TIGAR异位至线粒体,可降低线粒体ROS的生成并增加ATP,增强线粒体功能,减轻神经元损伤。因此,本课题提出“TIGAR通过调控SDH和琥珀酸保护神经元线粒体功能进而减轻脑缺血再灌注损伤”的假说。并通过TIGAR基因工程小鼠和慢病毒转染的神经元细胞分别建立tMCAO/R整体模型和OGD/R细胞模型,应用分子生物学技术揭示TIGAR对缺血缺氧诱导的神经元线粒体琥珀酸代谢的调控机制及其对神经元损伤的作用,进一步阐明TIGAR的细胞内抗氧化作用新机制。为TIGAR作为治疗有氧化应激参与的急慢性神经疾病尤其是缺血性卒中提供新的研究方向和靶点,为未来的缺血性脑卒中防治及新药研发提供新思路。研究方法:（1）建立短暂性大脑中动脉阻塞/复灌（Transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,tMCAO/R）模型,检测小鼠脑缺血再灌注过程中大脑皮层的琥珀酸含量及SDH活性,免疫印迹（Western blot,WB）检测SDH的催化亚基SDHA和SDH B的蛋白表达。（2）构建TIGAR敲除小鼠（TIGAR-KO）和TIGAR过表达小鼠（TIGAR-TG）,以脑梗死体积、脑含水量和神经行为学评分评估TIGAR对脑缺血再灌注损伤的影响,并检测TIGAR对缺血诱导的琥珀酸含量和SDH活性的影响。（3）通过慢病毒侵染构建过表达和敲低TIGAR的HT22稳转株,建立细胞糖氧剥夺/复糖氧（Oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型,检测 TIGAR 对OGD诱导的琥珀酸含量和SDH活性的影响。（4）评估SDH活性抑制剂丙二酸二甲酯（Dimethyl malonate,DMM）和琥珀酸的渗透性衍生物琥珀酸二甲酯（Dimethyl succinate,DMS）对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响。（5）通过CCK8检测DMM、DMS以及SDH的泛醌结合位点抑制剂AtpeninA5（AA5）对细胞OGD/R诱导的神经元死亡的保护作用,以及对胞内琥珀酸含量的影响。（6）通过ATP、ROS、胞内Ca2+浓度以及线粒体膜电位检测DMM、DMS、AA5对OGD后细胞线粒体功能的影响。（7）通过免疫荧光检测SDH和TIGAR的细胞共定位;免疫印迹和qPCR检测TIGAR对SDH A和SDH B的mRNA水平及蛋白表达影响;免疫共沉淀实验检测TIGAR对SDH A的乙酰化水平的影响。（8）评估DMM抑制SDH活化或DMS补充脑内琥珀酸含量对TIGAR-KO小鼠脑缺血再灌注损伤的影响。研究结果:（1）脑缺血再灌注期间,小鼠脑内琥珀酸含量持续下降及至再灌注1 h后稳定在较低水平;而SDH活性仅在缺血期及再灌注的前3h内发生活化;SDHA和SDH B的蛋白表达呈时间依赖性增加并在再灌注12-24 h达到顶峰。（2）过表达TIGAR显著减少tMCAO小鼠脑梗死体积、脑含水量和神经行为学评分;反之,敲除TIGAR显著增加tMCAO小鼠脑梗死体积、脑含水量和神经行为学评分。（3）过表达TIAGR显著抑制缺血或OGD诱导的胞内SDH活化及琥珀酸含量降低,上调胞内琥珀酸含量;而干扰TIAGR后,SDH过度活化,并加剧琥珀酸含量降低。（4）缺血前注射DMM和DMS能够显著减少tMCAO小鼠脑梗死体积,降低脑含水量和神经行为学评分。（5）DMM、DMS、AA5以剂量依赖性的方式显著减少OGD/R诱导的细胞死亡,并显著抑制OGD诱导的胞内琥珀酸含量降低,上调胞内琥珀酸含量。（6）DMM、DMS、AA5延缓OGD期间胞内ATP的耗竭,提高胞内ATP水平,抑制胞内ROS生成,抑制Ca2+内流并增加线粒体膜电位。（7）TIGAR和SDHA、SDHB均存在明显的线粒体共定位;过表达TIAGR显著抑制缺血或OGD诱导的SDH B的mRNA水平及蛋白表达上调,抑制SDH A的乙酰化水平降低;而干扰TIAGR后逆转了这一现象。（8）DMM和DMS均显著减少TIGAR-KO小鼠tMCAO/R后脑梗死体积,降低脑含水量和神经行为学评分。结论:小鼠脑缺血期间,脑内琥珀酸含量下降,SDH活化且蛋白表达量增加。缺血期抑制SDH活性或增加胞内琥珀酸含量能够保护线粒体功能。TIGAR对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其作用机制可能与调控SDH活性及上调胞内琥珀酸含量有关,为未来的缺血性脑卒中防治以及新药研发提供了新思路。