研究背景和目的肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,就诊时多数已是中晚期,且对化疗和放疗均不敏感,因此寻找肾癌新的治疗方法有其现实意义。RNAi是指由外源双链RNA (dsRNA)进入生物体内细胞后引起的与其同源序列的mRNA特异性降解而导致的基因沉默现象,作为一项新的基因阻断技术,有望成为新一代抗肿瘤的重要工具。近年来抗凋亡因子Clusterin(CLU)在肿瘤发生发展中的作用受到广泛关注,有望成为肿瘤基因治疗的新靶点。2006年1月本课题组研究发现CLU蛋白在肾癌中表达增加,并且其表达强度与肾癌恶性化程度、肿瘤转移、细胞凋亡间均存在相关性,但CLU是否参与肾癌恶性生物学行为的调控及如何调控尚不清楚。本实验在证实CLU基因在人肾癌786-O细胞中明显表达的基础上,应用慢病毒介导的RNA干扰技术,设计合成针对CLU基因的siRNA,通过与pGCSIL-GFP载体进行重组慢病毒表达载体。利用包装细胞293T获得重组的慢病毒,感染人肾癌786-O细胞,建立CLU基因稳定干扰的人肾癌786-O细胞系,为CLU基因的功能研究奠定基础。利用特异性地阻断肾癌786-O细胞系中CLU基因的表达,检测CLU基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖、迁移和凋亡的影响以及相关基因的差异表达,探讨CLU基因的可能作用途径及RNAi阻断策略抑制CLU蛋白表达对肾癌治疗的可行性。方法1、应用质粒重组技术以人CLU mRNA编码序列作为干扰靶点,与pGCSIL-GFP载体定向连接,构建pGCSIL-GFP表达载体,分别命名为CLU-RNAi-LV1#,2#,3#。另外构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒。慢病毒载体法将CLU正义表达载体转染293T细胞,利用包装细胞293T获得重组的慢病毒,分别感染人肾癌786-0细胞株及ACHN细胞株。经过抗性筛选,获得稳定转染CLU-RNAi-LV1#,2#,3#的细胞株。荧光显微镜下观察GFP表达、滴度测定,用786-0细胞检测转染效率2、运用Real-time PCR和Western分别检测786-0细胞株及ACHN细胞株中CLU mRNA转录水平及CLU蛋白表达水平的变化。应用MST-1法检测786-0细胞的生长状态,细胞划痕实验、流式细胞仪检测CLU沉默后肾癌786-0细胞在增殖、迁移、凋亡等生物学行为的改变。1) Real Time-PCR、Western blot检测RNAi作用下786-0细胞与ACHN细胞中CLU mRNA及蛋白的诱导表达；2)MST-1法观察抑制CLU基因表达对786-0细胞及ACHN细胞增殖能力的影响；3)细胞划痕实验比较RNAi抑制CLU基因前后786-0细胞迁移能力的改变。4)流式细胞术Hoechst33342/PI双染法比较RNAi抑制CLU基因前后786-0细胞凋亡率的改变。3、运用全基因组芯片检测CLU基因干扰前后相关基因的差异表达情况。统计学处理使用SPSS13.0统计软件进行统计处理。计量资料用x±s表示。计量资料进行one-way ANOVA单因素及析因方差分析。所有检验结果以P<0.05认为差异有统计学意义。结果1、成功构建人CLU基因特异性的重组慢病毒干扰载体CLU-RNAi-LV并获得相应的慢病毒,病毒悬液滴度4×108TU/mL。成功建立3组稳定转染CLU基因的肾癌细胞株CLU-RNAi-LV1#,2#,3#。2.Real Time-PCR.Western blot结果显示786-0细胞株中CLU mRNA表达水平及蛋白表达水平高于ACHN细胞株。786-0细胞中CLU mRNA表达量是ACHN细胞的2.44倍。两组CLU mRNA表达量三次平均ACT为13.67,F=84.944,P=0.012<0.05,差异有统计学意义。干扰组CLU mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,肾癌786-0细胞的增殖、迁移受到抑制,而凋亡率增加。通过RNA干扰作用有效地下调了786-0细胞中CLU基因在mRNA与蛋白水平上的表达,同时抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡。1)经Real Time-PCR,Western blot检测证实：CLU-RNAi-LV1#,2#,3#均能抑制肾癌786-0细胞及ACHN细胞中的CLU mRNA与蛋白质的表达,但786-0细胞中蛋白表达更低。786-0细胞中三实验组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调91.6%,83.1%,88.4%,90.4%,69.4%,58.7%,93.6%,96.5%和0。 CLU蛋白表达水平与NC组相比分别下降35.24%,46.26%,和58.91%,其中CLU-RNAi-LV3#效果较干扰效果最佳。2)细胞划痕试验检测RNA干扰24小时后各组0N/6h/12h/24h时点迁移相对距离：KD组(32.04±0.97)迁移距离远小于CON组(19.48±1.30)、NC组(19.67±4.94)(F=15.274,P<0.001)。三组间差别进行方差分析,实验组和对照组间差别有统计学意义,各时间点实验组和对照组差别有统计学意义(F=364.367,P<0.001),分组和时间存在交互效应(F=7.248,P<0.001)而NC组细胞和CON组间差异则无统计学意义(P=0.959>0.05)。显示RNAi后细胞的迁移能力下降。显示RNAi抑制细胞的恶性进展能力。3)MST-1法观察抑制CLU蛋白表达对786-0细胞增殖的影响：检测CLU基因沉默后的786-0细胞即实验组(OD值0.3413±0.0345)生长速度较NC组(OD值0.4175±0.0554)及CON组(OD值0.4145±0.0231)明显下降(P<0.05),转染后72h实验组的生长抑制率为15.66%。显示RNAi抑制细胞的增殖能力。4)流式细胞仪Hoechst33342/PI双染法比对RNAi抑制CLU基因前后786-0细胞凋亡率的改变；RNA干扰72h后786-0细胞凋亡率为6.30%±3.17%,阴性对照组及空白组分别为1.20%±0.40%,1.01%±0.37%(n=3)(P<0.01)。RNAi抑制sCLU表达并促进了细胞凋亡3、检测的六份样本中,共筛选出差异表达基因1853个,癌组织中共同上调基因1270个,共同下调基因583个。GO分析差异表达基因以生物进程、细胞成分、分子功能方面为主。通路分析上调29条通路,细胞粘附,葡萄球菌感染,吞噬体,异体排斥,自免性甲状腺疾病,造血系统,病毒性心肌炎。下调31条通路,与肺癌、前列腺癌、脑胶质瘤、髓细胞白血病、mTOR、MAPK等通路有关。结论1、慢病毒介导的CLU基因干扰能稳定有效地表达于肾癌细胞,筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-0细胞株。2、CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-0细胞的内源性CLU基因,下调肾癌786-0细胞CLU基因的表达。CLU基因RNAi干扰后肾细胞癌786-0的增殖活性受到抑制,细胞凋亡受到促进。针对CLU的shRNA能够有效的阻断肾癌细胞中CLU mRNA、蛋白的表达,并以此抑制体内、体外细胞的生长增殖,降低细胞耐药性、下调细胞的侵袭、迁移能力。3、肾细胞癌的发生发展中与CLU基因相关的基因有相对集中区域,如1、2、6、11号染色体,上调基因还集中于X染色体,下调基因还集中于12号染色体。与凋亡相关的下调基因如AKT3, CASP3, DFFB, IL1R1, PIK3D, PRKACB下调,其中CASP3基因下调4倍以上。肿瘤转移与血管生成相关基因如ITGB3,NF2,RB1,EPH receptor B2下调。从基因的功能分类看,差异表达基因生物进程、细胞成分、分子功能方面均以下调为主。下调通路半数以上是肿瘤相关通路。这些结果进一步提示CLU基因与肾细胞癌的发生发展密切相关,并寻找到肿瘤进展的一些通路线索,为以CLU基因为靶点的肾癌基因治疗研究提供了实验依据。