目的:NUPR1是转录调节因子,应激条件诱导其表达增加并参与细胞增殖和细胞周期等重要过程。以往研究发现,NUPR1参与肿瘤的发生发展调控。NUPR1能够促进乳腺癌细胞的内质网应激、神经胶质瘤细胞的增殖、胰腺癌细胞的恶性进展等重要过程。另外,NUPR1还参与诱导癌细胞的早熟性衰老与凋亡,对癌症的发展具有抑制作用。在癌症患者中,自噬被认为通过调节肿瘤细胞内环境稳态参与肿瘤发展。然而,自噬的调控机制尚属未知。NUPR1能够参与自噬的调节已有报道。目前,NUPR1对肺癌的自噬研究少有报道。通过该项研究,在非小细胞肺癌细中探索NUPR1对肺癌患者生存期的关联,求证NUPR1对自噬进程的调控机制,以期对肺癌的发生发展有更充分地认识,为肺癌的靶向治疗提供理论基础。方法:本研究分为三部分。第一部分研究NUPR1在肺癌患者的表达情况;第二部分探索改变NUPR1表达后,肺癌细胞产生的生命活动变化;第三部分研究NUPR1对肺癌细胞的转录调控机制。第一部分:通过免疫组织化学染色分析肺癌患者组织芯片中NUPR1的表达水平,统计分析NUPR1与肺癌患者生存期之间的关联。利用RT-PCR与Western blot实验检测正常人支气管上皮细胞系与多种肺癌细胞中NUPR1的表达水平。第二部分:利用慢病毒介导的RNA干扰技术在肺癌细胞系中下调NUPR1的表达,通过光学显微镜观察肺癌细胞的形态学改变,利用中性红染色、吖啶橙染色、Lyso-Tracker Red染色对下调NUPR1表达的肺癌细胞所发生的形态改变进行分析,通过Western blot检测相关途径的蛋白分子标记物的表达水平差异,然后进行Brd U细胞增殖实验、流式细胞仪细胞周期检测实验、软琼脂克隆形成能力实验、小鼠皮下注射成瘤等实验,对下调NUPR1表达的肺癌细胞所发生的生物学功能改变进行检测。第三部分:下调NUPR1的肺癌细胞提取总RNA,与对照组细胞进行转录组对比分析,验证差异表达基因。通过Ch IP实验、荧光素酶报告基因实验证实NUPR1的直接调控基因SNAP25,然后下调SNAP25检测细胞功能改变并通过过表达SNAP25进行细胞功能恢复实验。通过免疫沉淀质谱分析鉴定SNAP25在维持肺癌细胞自噬功能过程中的共同作用蛋白。结果:第一部分研究结果显示:在肺癌细胞系中NUPR1的蛋白表达水平显著高于正常人肺支气管上皮细胞系NHBE;对肺癌组织芯片进行免疫组织化学染色(IHC)分析,IHC染色结果显示,组织芯片中118例肺癌组织中NUPR1蛋白在患者肺癌组织中高表达,22例癌旁对照组织中NUPR1蛋白低表达;NUPR1低表达的肺癌患者生存期明显优于高表达NUPR1的肺癌患者(P<0.01)。第二部分研究结果显示:下调NUPR1后的A549细胞内出现大量囊泡,随着时间推移实验组细胞大量死亡;中性红染色、吖啶橙染色、Lyso-Tracker Red染色均为阳性,下调NUPR1诱导肺癌细胞产生的囊泡为酸性结构;下调NUPR1诱导肺癌细胞自噬溶酶体外排释放功能受损,导致自噬溶酶体的体积增大形成囊泡,并且囊泡在自噬缺陷的肺癌细胞中无法形成;下调NUPR1诱导肺癌细胞早熟性衰老,削弱肺癌细胞增殖能力和成克隆能力。第三部分研究结果显示:下调NUPR1的A549细胞与对照组细胞进行转录组测序对比,自噬和溶酶体途径的诸多基因转录改变,例如ATG9B、LCN2、TPPP3、SNAP25和SQSTM1等;下调SNAP25诱导肺癌细胞产生的囊泡,诱导肺癌细胞早熟性衰老,削弱肺癌细胞增殖能力;过表达SNAP25可部分消除NUPR1缺失引起的囊泡,进而证实SNAP25是NUPR1的直接操控基因。