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第一部分 缺氧对三阴性乳腺癌干细胞富集及基因表达的影响目的:研究缺氧对人乳腺癌干细胞微球体培养成球率的影响及对基因表达的影响。方法:常规培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,分别在常氧和缺氧条件下悬浮培养及富集乳腺癌干细胞(breast cancerstem cells,BCSCs)MDA-MB-231微球体,观察其成球率。流式细胞术检测CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞比例。免疫磁珠法分选CD44+/CD24-/low表型乳腺癌干细胞。细胞因子抗体芯片检测常氧与缺氧乳腺癌干细胞基因表达。结果:1.缺氧组BCSCs微球体成球率80.22±0.05%,优于常氧组的60.21±0.07%(P<0.05)。2.流式细胞术检测缺氧组CD44+/CD24-/low表型BCSCs 比例78.63±0.03%,高于常氧组的55.32±0.06%(P<0.05)。3.细胞因子抗体芯片检测,发现缺氧组与常氧组BCSCs 比较有20个基因表达明显上调。结论:缺氧状态可以提高BCSCs微球体成球率,并增加CD44+/CD24-/low表型BCSCs 比例。缺氧BCSCs与常氧比较有20个基因表达明显上调,如ⅠGF-Ⅱ,L-Selectin等。第二部分 黄芩苷抑制缺氧三阴性乳腺癌干细胞的作用研究目的:在体内外实验中研究黄芩苷对缺氧三阴性乳腺癌干细胞MDA-MB-231的抑制效应。方法:在体外实验中用MTT法检测黄芩苷对缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231增殖的影响。在体内实验中,建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,观察裸鼠一般状况及体重,移植瘤的体积及重量变化,检测移植瘤的病理形态改变,免疫组化检测移植瘤ER,PR,Her-2的表达,乳腺癌干细胞标志物CD44,CD24的表达。组织芯片检测BCSCs标志物CD44、CD24、CD133的表达。结果:1.MTT法检测发现黄芩苷能抑制缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231的增殖,而且呈浓度依赖性,高剂量组200mg/L的抑制效果最好(P<0.05)。2.体内实验中,成功建立裸鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型。3.黄芩苷中剂量(100mg/L)及高剂量组(200mg/L)能改善裸鼠一般状态,减小移植瘤的体积及重量(P<0.05)。黄芩苷中、高剂量组可以减少BCSCs标志物CD44、CD24、CD133的表达(P<0.05)。结论:黄芩苷在体内外能抑制乳腺癌干细胞MDA-MB-231的增殖及分化。第三部分 黄芩苷抑制缺氧三阴性乳腺癌干细胞的相关机制研究目的:基于HIF-1α/IGF-Ⅱ信号通路探讨黄芩苷抑制缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231 的机制。方法:用Real-time PCR检测黄芩苷干预后缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231的HIF-1α,ⅠGF-Ⅱ,L-S electin的mRNA表达变化,Western-blot检测HIF-1a、ⅠGF-Ⅱ、L-Selectin的蛋白表达。组织芯片检测裸鼠移植瘤HIF-1a、ⅠGF-Ⅱ、L-Selectin的蛋白表达。结果:1.黄芩苷干预后缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231的HIF-1α,ⅠGF-Ⅱ,L-Selectin的mRNA及蛋白表达均下降(P<0.05)。2.裸鼠黄芩苷组移植瘤HIF-1a、ⅠGF-Ⅱ、L-Selectin的蛋白表达下降(P<0.05)。结论:黄芩苷在体外可以下调缺氧乳腺癌干细胞MDA-MB-231的HIF-1α,ⅠGF-Ⅱ,L-Selectin的表达,在体内可以下调移植瘤HIF-1a、ⅠGF-Ⅱ、L-Selectin的表达,黄芩苷抑制缺氧三阴性乳腺癌干细胞的作用可能与调节HIF-1 a/ⅠGF-Ⅱ信号通路及L-Selectin的表达有关。