乳腺癌是严重危害女性健康的常见的恶性肿瘤之一，中国女性乳腺癌的发病率与世界多数发达国家相比虽然较低，但从20世纪末到21世纪初的短短20年里，该病发病率已急速上升，而且发病年龄也逐渐年轻化，使得这一疾病的危害更加显著。半个世纪以来，传统的乳腺癌治疗发生了划时代的变化，由单纯手术治疗转变为以外科手术为主，联合放疗、化疗、内分泌治疗等的综合治疗。尽管人们对乳腺癌的生长、浸润及转移的机理等生物学特性方面做了深入的研究，取得了较大的进步，但是，乳腺癌患者的死亡率仍徘徊在20/10万左右。研究其侵袭及转移的机理等生物学特性，以及利用分子生物学技术，阻断肿瘤细胞侵袭、浸润和转移的靶点，已成为当前研究的热点之一。　　 RNA干涉(RNAi)是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，它是由dsRNA介导的、Dicer酶参与的特异性基因沉默现象，可以在转录水平、转录后水平及翻译水平上特异性阻断目的基因的表达。端粒酶(telomerase)是由一个互补于端粒DNA的RNA亚基和具有逆转录酶活性的端粒酶催化亚基(TERT)及相关蛋白组成。端粒酶活性的表达与细胞衰老和某些疾病，特别是肿瘤的发生、发展密切相关。TERT被普遍认为是端粒酶的催化亚基，其基因的表达与端粒酶的激活密切相关。端粒酶特异性高表达于包括乳腺癌在内的绝大部分恶性肿瘤，而绝大多数正常组织几乎不表达的特性使之成为肿瘤治疗的优选靶点。通过特异性下调TERT基因表达改变肿瘤细胞端粒酶活性，伴随端粒酶活性改变，肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等生物学特性随之改变。　　 端粒酶在乳腺癌细胞中的表达如何？端粒酶活性与乳腺癌细胞增殖、浸润、转移等生物学特性关系如何？下调端粒酶活性对乳腺癌上述生物学活性的影响如何？为回答上述相关问题，本研究拟利用RNAi技术，设计针对hTERT基因mRNA特异性短发夹干扰片段，利用分子克隆技术，重组pSUPER_retro_puro质粒，经鉴定正确后转染乳腺癌MCF-7、MDA-MB231细胞系，建立端粒酶活性下调的乳腺癌细胞系，检测转染前后细胞端粒酶活性变化，通过MTT法、软琼脂集落形成形成实验等对细胞增殖；划痕实验对细胞迁移；Transwell实验对细胞侵袭能力；以及转染后细胞对电离辐射、化疗药物作用的敏感性等进行研究，探讨下调端粒酶活性对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及对放化疗敏感性的影响，初步探讨端粒酶为靶点的乳腺癌基因治疗结合传统肿瘤治疗方法的效应等相关问题。　　 材料和方法:　　 1、靶向hTERT基因mRNA的shRNA质粒表达载体的构建　　 设计并采用化学合成法合成靶向hTERT基因mRNA序列的短发夹寡核苷酸序列，经退火后连接到线性化pSUPER_retro_puro质粒BgIII和HND III酶切位点之间，构建hTERT shRNA表达质粒载体pSUPER_retro_puro-TERT-RNAi＃1、＃2(pSUPER-TERT-RNAi＃1、＃2)，经EcoRI和HINDIII双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，验证插入目的基因片段位置及序列正确性。　　 2、稳定表达细胞系建立和转染前后细胞端粒酶活性及hTERT基因mRNA水平和蛋白水平变化　　 采用磷酸钙法将扩增纯化后的pSUPER-TERT-RNAi＃1、＃2重组质粒(转染组)及pSUPER_retro_puro质粒(阴性对照组)分别转染MCF-7和MDA-MB-231细胞系，经puromycin药物筛选，建立稳定表达的阳性细胞克隆。采用Trizol法收集细胞总RNA，经逆转录合成cDNA，设计hTERT mRNA引物，选取GAPDH为内参对照，RT-PCR检测mRNA水平；收集各组细胞总蛋白，选取α-tubulin为内参对照，Western blotting检测各组细胞端粒酶蛋白表达，TRAP-ELISA方法检测细胞端粒酶活性，与阴性对照组及未经处理的MCF-7和MDA-MB231细胞系(空白对照组)比较各组间差异。　　 3、端粒酶活性下调对乳腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭能力的影响　　 采用MTT法、琼脂糖凝胶克隆形成检测转染前后乳腺癌细胞增殖活性，划痕实验检测转染前后乳腺癌细胞迁移能力，同时利用Transwell实验检测转染前后乳腺癌细胞的侵袭能力等的变化，评价端粒酶活性下调后对乳腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭能力的影响。　　 4、端粒酶活性下调对乳腺癌细胞电离辐射、化疗药物敏感性的影响　　 选取常用化疗药物阿霉素经稀释后加入各组细胞培养液中或利用UV-crosslink对各组细胞进行UV照射，经一定时间培养后，利用MTT法对不同时间点各组细胞增殖活性进行检测，探讨端粒酶活性下调对乳腺癌细胞放疗、化疗敏感性的影响。　　 5、数据统计处理分析　　 细胞学实验采用图片说明，各组间差异通过软件进行量化后应用SPSS16.0统计软件包对量化数据进行统计学分析，判别各组间差异的统计学意义。　　 实验结果:　　 1、靶向hTERT基因mRNA的shRNA质粒表达载体的构建　　 重组构建pSUPER- TERT-RNAi＃1、＃2经EcoRI和HINDIH双酶切电泳分析显示目的片段成功插入正确位置；选取酶切正确重组质粒克隆送序列检测分析结果表明合成序列成功插入预定位点，且序列与设计合成的完全一致。说明成功构建hTERT shRNA表达质粒载体。　　 2、稳定表达细胞系建立和转染前后细胞端粒酶活性及hTERT基因mRNA水平和蛋白水平变化　　 转染组和阴性对照组细胞经puromycin药物筛选两周后，成功构建阳性克隆。与空白对照组相比，转染组端粒酶活性下调明显，其中MCF-7细胞系RNAi＃1下调至50.88±13.41％，RNAi＃2组下调至35.45±6.20％，MDA-MB231细胞系RNAi＃1下调至49.47±7.1％，RNAi＃2组下调至42.40±8.37％，差异有统计学意义，阴性对照组端粒酶活性无明显变化；与空白对照组相比，转染组细胞hTERT基因mRNA水平明显下降，其中MCF-7细胞系RNAi＃1相对积分光密度为54.89±1.06％，RN Ai＃2组为49.90±4.98％，空白对照组为99.18±6.62％，差异有统计学意义，阴性对照组为98.19±2.84％，差异无统计学意义。MDA-MB231细胞系RNAi＃l组相对积分光密度为56.64±10.79％，RNAi＃2组为50.00±3.16％，空白对照组为101.85±4.34％，差异有统计学意义，阴性对照组为102.22±2.47％；空白对照组和阴性对照组差异无统计学意义。　　 3、下调端粒酶活性对乳腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭能力的影响　　 MTT法检测细胞增殖活性能力显示，MCF-7及MDA-MB231转染组细胞增殖活性较空白对照组低，并分别从第2天和第3天起，差异有统计学意义。软琼脂集落形成实验提示MCF-7和MDA-MB231转染组细胞克隆形成能力较空白对照组分别下降58.37±1.85％和62.80±0.78％，划痕实验实验显示MCF-7细胞学转染组细胞迁移能力减弱；Transwell实验则证实MDA-MB231转染组细胞侵袭能力较空白对照组减弱54.96±4.03％，差异有统计学意义；上述实验空白对照组和阴性对照组差异无统计学意义。　　 4、下调端粒酶活性对乳腺癌细胞接受电离辐射、化疗药物治疗敏感性的影响　　 通过阿霉素模拟化疗药物作用，UV照射模拟电离辐射实验，并利用MTT法对不同时间点各组细胞增殖活性进行检测发现转染组细胞较空白对照组细胞接受放、化疗后细胞增殖活性持续明显下降，并呈现不可逆性表现，对照组与空白对照组无明显差异，说明端粒酶下调后乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞对电离辐射、化疗药物敏感性增加。　　 结论:　　 1、通过RNAi技术特异性干扰hTERT基因mRNA表达可显著下调细胞端粒酶活性；　　 2、乳腺癌细胞端粒酶活性下调可导致细胞增殖活性、迁移及侵袭能力的下降；　　 3、端粒酶活性下调后可增加乳腺癌细胞对电离辐射、化疗药物的敏感性；　　 4、以端粒酶为靶点的基因治疗联合电离辐射、化疗等可能是乳腺癌治疗的一种有效方法。