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Prox1（Prospero-related homeobox protein 1,Prox1）蛋白是homeo-box转录因子家族中的一个重要成员,在脊椎动物胚胎时期的神经、肝脏、心脏、眼睛和淋巴系统等组织器官发生发育过程中发挥了重要作用,并且其表达和功能的改变还与多种人类癌症相关。Prox1蛋白含有homeo-prospero结构域和prospero结构域,并且homeo-prospero与prospero结构域形成的同源结构域能特异性结合DNA,调节其它基因的转录。目前,Prox1基因的研究主要集中在人和小鼠,对果蝇、蝾螈、爪蟾、金鱼和斑马鱼也有一些研究。人、小鼠、爪蟾、金鱼和斑马鱼的Prox1基因c DNAs已得到了克隆、序列分析和功能研究,但是鸡Prox1基因的克隆、亚细胞定位以及在鸡组织发育过程中的表达情况尚不清楚。本研究首先对鸡Prox1基因的完整CDS区进行克隆和生物信息学分析,研究鸡Prox1蛋白的亚细胞定位并鉴定介导其细胞核定位的核定位信号,同时采用荧光定量PCR技术检测Prox1基因在鸡胚胎期14天（E14 d）、0日龄（0 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d）不同组织中的表达情况,分析其在鸡胚组织发育过程中的表达规律。1.鸡Prox1基因的克隆和生物信息学分析根据Gen Bank已发表的鸡Prox1基因序列（NM＿001005616.1）设计合成引物,以鸡眼睛提取的总RNA反转录产物为模板,通过PCR扩增Prox1基因CDS区,利用生物信息学软件,对Prox1蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、亚细胞定位、互作蛋白、蛋白结构域和系统进化树进行分析。结果表明:从鸡眼睛提取的总RNA反转录产物中成功扩增出鸡Prox1基因CDS区,其长度为2211 bp,共编码736个氨基酸,理论p I为6.62,相对分子质量约为82.86 ku,分子式为C3601H5671N1049O1136S32。序列分析表明,鸡Prox1蛋白二级结构主要是由无规则卷曲（占53.67%）和α螺旋组成（占39.40%）。亚细胞定位和互作蛋白预测结果显示:鸡Prox1蛋白主要定位在细胞核,与其互作的细胞蛋白主要有LYVE1、PAX6、KDR、VEGFC和FLT4。核苷酸同源性及遗传进化分析发现,鸡与鹌鹑Prox1基因核苷酸同源性最高（为97.8%）,并且与鹌鹑的亲缘关系最近。以上研究为下一步开展鸡Prox1蛋白细胞核定位信号的鉴定和组织表达特性提供基础。2.鸡Prox1蛋白细胞核定位信号的预测和鉴定以构建的鸡Prox1基因重组克隆质粒p CR2.1-Prox1为基础,构建鸡Prox1基因的重组真核表达载体p EGFP-Prox1,将其转染HEK-293T细胞,通过Western blotting方法检测重组蛋白的表达,同时利用倒置荧光显微镜观察和分析重组蛋白的亚细胞定位。另外,运用在线软件预测鸡Prox1蛋白中假定存在的NLS（putative NLS,p NLS）,构建鸡Prox1蛋白p NLS缺失体重组真核表达载体,转染细胞后通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位来确定NLS。同时,将鉴定的鸡Prox1蛋白NLS进行保守性分析,并检测其对外源蛋白的核输入能力。另外,将NLS中的碱性氨基酸位点进行突变,鉴定鸡Prox1蛋白NLS中的关键碱性氨基酸位点。结果表明,成功构建了鸡Prox1基因的重组真核表达载体p EGFP-Prox1,转染细胞后重组蛋白EGFP-Prox1正确表达;荧光观察和亚细胞定位分析结果显示EGFP-Prox1重组蛋白主要定位在细胞核。对鸡Prox1蛋白NLS预测结果显示,鸡Prox1蛋白中共存在6个p NLS。进一步对p NLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位分析发现,p NLS1(15KRRR18)和p NLS2(163RAKRAR168)共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。另外,鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2基序在其它禽类、人和不同哺乳动物间均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。此外,碱性氨基酸点突变试验结果证实,K15、R16和R18,K165、R166和R168分别是鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2中的关键碱性氨基酸位点。以上研究结果表明,两个高度保守的NLS1(15KRRR18)和NLS2(163RAKRAR168)共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。3.鸡Prox1基因在鸡胚不同发育阶段不同组织中的表达特性分析分别采集鸡胚胎期14天（E14 d）、0日龄（0 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d）4个时间点的眼、脑、心、肝、肺、胃、胸肌和腿肌的样品。提取总RNA并反转录成c DNA,设计荧光定量PCR引物,通过荧光定量PCR方法检测Prox1基因在鸡肝、肾、脑、眼睛、肌肉不同阶段组织中的表达量,分析Prox1基因在鸡不同组织发育过程中的表达情况。结果表明,Prox1基因在鸡E14 d和7 d的胃中表达最高;0 d和14 d的肺脏中表达最高。表达规律显示:Prox1基因在眼睛和脑中表达稳定;心脏中7 d前表达稳定,7 d后开始呈上升趋势;肝脏和肺脏中均在E14 d时表达最低,14 d时表达最高,整体呈上升趋势;胃和腿肌中在E14 d时表达最高,0 d时表达最低,7 d时有较高表达,呈“W”表达趋势;胸肌中,E14 d到7 d阶段表达逐渐增加,在7 d时达到最高,之后开始下降,到14d表达最低。以上研究为后续开展Prox1基因调控鸡相关组织发育研究奠定基础。