中性粒细胞（Polymorphonuclears,PMNs）是动物体中数量最多的白细胞类型,是固有免疫中第一个募集到炎症部位的细胞,它可通过特有的中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps,NETs）的形式响应外来刺激。冷刺激是东北地区常见的应激源,它不仅会造成机体内环境稳态的紊乱,也会破坏机体的免疫功能,导致炎症的发生。有研究显示,冷暴露可以激活PMNs,但对NETs的研究尚未见报道。那么,冷暴露是否可以诱导PMNs形成并释放NETs呢?TLR2和TLR4所介导的NF-κB信号通路在此过程中有哪些作用呢?因此,在揭示冷暴露是否能够诱导NETs形成的同时,又初步阐明了冷暴露是如何通过TLR2和TLR4影响NETs形成的机制,为NETs在冷应激领域的研究奠定其理论基础。为探究冷暴露能否诱导小鼠腹腔原代PMNs形成NETs,将8周龄雄性小鼠随机分为冷暴露组和常温对照组,冷暴露组小鼠每天以不同时间点在4°C人工智能气候室中饲养3h,连续7 d。首先通过检测小鼠血液生化指标发现AST、CK、Ca、AMY的含量均有不同程度的升高,TG和GLU含量有明显的降低（P<0.05、P<0.01、P<0.001）。再通过免疫荧光和CCK-8的方法检测PMNs的纯度和细胞活力,发现纯度在90%左右,且冷暴露后的PMNs活力降低（P<0.001）。随后又通过免疫荧光、扫描电镜、cf DNA定量及蛋白质免疫印迹的方法判定冷暴露是否能够诱导NETs的产生。结果发现,与常温对照组相比冷暴露组有纤维网状结构生成,PMNs表面有明显的皱缩,且有类似于伪足的结构伸出;cfDNA浓度和组件蛋白瓜氨酸化组蛋白H3（Citrullinated histone 3,CitH3）、髓过氧化物（Myeloperoxidase,MPO）的蛋白表达量均有明显的升高（P<0.001）。为进一步确定冷暴露作为内源性刺激可以诱导NETs的形成,我们选用外源性刺激物LPS进行比较分析。结果显示,与常温对照组相比其它处理组均形成了NETs,核酸骨架cfDNA浓度和组件蛋白表达水平检测结果与其相符（P<0.01、P<0.001）。q-PCR和通路蛋白检测结果显示,冷暴露组的NETs相关基因PAD4、MMP-9和炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达量均升高（P<0.01、P<0.001）;TLR2、TLR4以及NF-κB通路蛋白My D88、p65、p-p65、IκB和p-IκB的蛋白表达量均升高（P<0.05、P<0.01、P<0.001）,说明了冷暴露作为内源性刺激可以诱导NETs的形成,破坏机体稳态平衡、降低对外源性刺激物的抵御能力,活化TLR2和TLR4进而启动它们所介导的NF-κB信号通路。为进一步探讨TLR2和TLR4所介导的NF-κB信号通路在冷暴露诱导NETs形成过程中的作用,我们选用TLR2-/-和TLR4-/-基因敲除（KO）小鼠进行以下研究。首先对其基因型进行鉴定,确认成功敲除后检测了KO小鼠血液生化指标,结果显示ALB、GLOB、TP、ALT、AST、B/C、PHOS、CK、TG、GLU的含量均有不同程度的升高,A/G和Crea的含量均有不同程度的降低（P<0.05、P<0.01、P<0.001）。随后检测了KO小鼠和C57BL/6（WT）小鼠在冷暴露条件下NETs的形成情况及数量。结果显示,与常温对照组相比冷暴露组的小鼠均形成了串珠样的纤维网状结构,细胞表面发生褶皱,有伪足伸出。cfDNA检测结果显示,与常温对照组相比冷暴露组浓度显著升高（P<0.001）,但KO小鼠的cfDNA浓度与WT小鼠相比较低（P<0.001）。接下来又检测了KO小鼠内源性的冷暴露和外源性的LPS刺激对NETs形成的影响,结果发现纤维网状结构的形成、PMNs的形态变化、cfDNA浓度以及组件蛋白CitH3、MPO的蛋白表达水平均与相同方式处理的WT小鼠有相同的趋势。q-PCR检测发现KO小鼠在冷暴露条件下NETs相关基因PAD4、MMP-9和炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达量均显著升高（P<0.01、P<0.001）。说明了TLR2、TLR4基因的敲除对NETs的形成存在一定的影响,但仍有少量的NETs形成。结论:1.冷暴露能够诱导小鼠腹腔原代PMNs形成NETs。2.NETs形成增加是通过TLR2、TLR4所介导的NF-κB信号通路。