类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以滑膜慢性炎症、关节软骨和骨的破坏为特点的一种系统性疾病。滑膜衬里层的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA的发病中起到了关键作用。弗林蛋白酶(furin)是前体蛋白转化酶(proprotein convertases, PCs)家族的重要成员之一,参与多种活性肽前体的活化过程。且furin在RA的滑膜翳和FLS中呈现出高表达。我们的论文着重研究furin对RA的FLS生物学功能的影响。另外,枯草杆菌样蛋白原转化酶(proprotein convertase subtilisin/kexin type 6, PCSK6)也是PC家族成员之一,在RA的滑膜中也表型出高表达,我们同时也研究了PCSK6在RA的FLS中的作用,以分析两者的作用是否相似。中文论文分为四个部分：第一部分为综述：类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞；第二部分为综述：弗林蛋白酶furin——胚胎发育和疾病发生：第三部分：抑制furin表达对类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖、侵袭、迁移和分泌功能的影响；第四部分：抑制PCSK6对类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖、侵袭、迁移和分泌功能的影响。第一部分类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞RA是一种以关节滑膜炎症和关节软骨的破坏为特征的系统性自身免疫性疾病,目前在临床上虽然治疗手段很多,但仍没有特异性的治愈方法。RA的发病机制极其复杂,包含许多类型细胞的参与：T细胞、B细胞、巨噬细胞和FLS。分布于滑膜衬里层的FLS通过分泌多种介质,包括细胞因子、化学因子、生长因子和其他的一些促炎性分子如前列腺素和白介素等,在炎症的发生、维持、关节软骨破坏过程中到起关键作用。RA的FLS可以表现出一些肿瘤细胞的特性,可能与P53基因功能的失活有关,产生独特的侵袭性表型,使其能够侵袭细胞外基质,进一步加剧关节损伤。FLS是RA发病过程中的关键因子之一。最近针对FLS的生物学研究进展包括它对固有免疫的调节、细胞内信号通路的调节等。对FLS的深入研究可以发现,FLS可以作为RA患者的一个新的治疗靶点,从而完善目前RA的治疗。第二部分弗林蛋白酶furin-——胚胎发育和疾病发生弗林蛋白酶furin在体内介导了一个简单的生化反应,催化前体蛋白水解为成熟蛋白。虽然这个反应看似简单,furin生理作用却极其重要。它参与了人体内的多种生理过程,是维持人体稳态平衡的重要分子。与furin相关的疾病相当广泛,包括：阿尔茨海默病、肿瘤、炭疽和埃博拉出血热等等。本篇综述主要概括了furin的结构、活性、细胞内定位、细胞内转运、作用底物、生物学特性以及与胚胎发生和多种疾病的关系。第三部分抑制furin表达对类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖、侵袭、迁移和分泌功能的影响研究背景类风湿性关节炎RA是以滑膜慢性炎症、关节软骨和骨的破坏为特点的一种系统性疾病。在RA中,正常滑膜从相对的静止状态转变为具有增殖性和侵袭性的滑膜翳组织。RA的发病机制非常复杂,多种细胞类型参与其中,如淋巴细胞、巨噬细胞和滑膜细胞。其中,滑膜衬里层的FLS在RA的发病中起到了关键作用。FLS分泌一系列细胞因子、炎性介质以及多种蛋白水解酶,介导局部的炎症反应,以及参与降解细胞外基质和软骨蛋白。RA患者来源的FLS的生物学特性不同于健康个体或骨性关节炎患者。这些炎性滑膜来源的滑膜细胞表现出一些转化细胞的表型特征,如细胞的锚定不依赖性生长、过度增殖、细胞侵袭、以及对凋亡诱导的耐受等。在体外培养此类细胞时,这些滑膜细胞在没有T细胞存在的情况下仍然可以长时间保持其侵袭力和破坏力。说明RA的关节破坏除了T细胞参与的自身免疫调节等机制,也有不依赖T细胞的以FLS为中心的机制。这类滑膜细胞是关节自分泌/旁分泌调控网络中的关键因子,加重关节滑膜慢性炎性状态和关节破坏。RA的最近的一些治疗进展主要集中于针对炎性细胞因子和淋巴细胞免疫的生物治疗,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)抑制剂,T细胞共刺激信号抑制剂,和B细胞清除剂等。在部分患者中这些生物治疗是有效的。但仍有很大一部分患者对以上这些生物制剂没有应答。因此,寻找新的治疗靶点,尤其是针对RA的FLS的治疗可能会完善现有治疗方案。Furin是PCs家族的重要成员之一,广泛分布于机体各种细胞中。Furin主要位于细胞内高尔基体外侧网络(trans-Golgi network, TGN),并在高尔基体外侧网络和细胞膜之间循环转运。Furin能够通过识别、剪切特定序列Arg-Xaa-(Lys/Arg)-Arg,水解多种前体蛋白,这一剪切过程是多种蛋白成熟活化的关键步骤,对蛋白质的功能起到重要的调节作用。最近的研究表明,furin参与了胚胎发育、机体稳态和多种疾病发生发展等过程。然而在生殖细胞中敲除furin会使胚胎死亡,因此furin在各种细胞中的作用缺乏基因敲除动物这种有利的研究手段。既往有实验发现RA患者的关节滑膜翳中furin的表达明显增加,但机制和作用尚不明了。Furin表达的上调可能会促进关节滑膜炎症,也可能是滑膜对炎症反应或自身免疫时的一种代偿。因此,研究滑膜细胞上高表达的furin的作用是一个亟需解决的课题。为了研究这个课题,我们设计了一系列实验。将RA患者来源的FLS进行体外培养,将其高表达的furin使用RNA干扰技术进行基因抑制,研究抑制furin对滑膜细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期、细胞凋亡、分泌炎症因子的影响。从而证明furin在滑膜细胞生物学功能中的作用。研究目的探索RA患者FLS细胞上高表达的furin对细胞的生物学功能的影响。研究方法我们从RA患者行膝关节置换术后的滑膜组织中消化分离FLS进行体外培养,瞬时转染小干扰RNA抑制细胞内furin表达,并设置对照组小干扰RNA,验证siRNA-furin的干扰效率。进一步的研究使用两组furin差异表达的FLS进行以下功能学实验：(1)MTT细胞增殖实验；(2)Transwell细胞侵袭实验；(3)单层细胞划痕实验；(4)细胞周期分析；(5)细胞凋亡分析；(6)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测FLS分泌白细胞介素(interleukin, IL)IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17和TNF-a水平。研究两组细胞在增殖、侵袭、迁移、凋亡、分泌等生物学功能中的差异。结果我们利用siRNA-furin或siRNA-control干扰RA患者的FLS上furin的表达,研究其功能差别。得到以下结果：(1) siRNA-furin在mRNA水平和蛋白水平均有效抑制FLS的furin表达。(2)RA滑膜来源的FLS上furin表达的下调增强FLS细胞的增殖、侵袭和迁移能力；(3)抑制furin表达加速FLS的细胞周期；(4)抑制furin表达影响FLS的凋亡,晚期凋亡和坏死细胞减少；(5)抑制furin的表达使FLS分泌TNF-a和IL-1β增加；结论(1)抑制RA滑膜FLS细胞上furin的表达增强了FLS细胞的增殖、侵袭、迁移和分泌炎症因子等功能；(2)RA滑膜细胞上furin的高表达可能是一种代偿性反应,抑制滑膜细胞的增殖、侵袭、迁移等表型；(3) Furin在循环和局部的作用不尽相同,具体机制有待进一步研究。研究意义RA是一种高度异质性疾病,炎症、免疫、代谢等多个方面参与其发病机制。毫无疑问,关节滑膜衬里层的FLS是疾病的关键因子之一。我们发现,抑制RA滑膜细胞上高表达的furin基因会增强细胞的增殖、侵袭、迁移和分泌炎症因子的能力。因此furin可能会作为RA的治疗靶点之一从而完善现有治疗。第四部分抑制PCSK6对类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖、侵袭、迁移和分泌功能的影响类风湿性关节炎RA是以滑膜慢性炎症、关节软骨和骨的破坏为特点的一种系统性疾病。RA来源的FLS表现出类似转化细胞的侵袭特性,通过分泌一系列细胞因子、炎性介质以及多种蛋白水解酶,介导局部的炎症反应,参与降解细胞外基质和软骨蛋白,加重RA的关节损害。PCSK6是一种Ca2+依赖的丝氨酸蛋白水解酶,参与多种肽的活化过程。既往研究显示PCSK6具有增强肿瘤细胞侵袭性和增值能力的作用。而且与骨性关节炎相比,PCSK6在RA滑膜上表达增高。因此我们设计一系列实验研究PCSK6对RA来源的FLS生物学功能的影响。研究目的探索RA患者FLS细胞上PCSK6的表达对细胞的生物学功能的影响。方法和结果我们从RA患者行膝关节置换术后的滑膜组织中消化分离FLS进行体外培养,应用siRNA转染FLS细胞抑制PCSK6表达,并行qRT-PCR和Western blot检测验证PCSK6在mRNA和蛋白水平表达的降低。细胞转染后进行的功能学实验包括：(1)MTT细胞增殖实验,证明抑制RA FLS细胞PCSK6表达降低细胞的增殖能力；(2)Transwell细胞侵袭实验,证明降低RA FLS细胞PCSK6表达抑制FLS细胞的侵袭能力；(3)单层细胞划痕实验,证明抑制]PCSK6表达后RA FLS细胞迁移能力降低；(4)ELISA检测FLS分泌功能,证明抑制]PCSK6的表达使RA FLS分泌TNF-α水平降低。结论(1)抑制PCSK6的表达降低了RA滑膜FLS细胞的增殖、侵袭、迁移和分泌炎症因子等功能；(2)RA滑膜细胞上高表达的PCSK6可能通过促进FLS的增殖、侵袭、迁移等加速RA的关节损害；(3) PCSK6和furin虽然同属PCs家族,但对RA FLS细胞生物学功能的影响不同,具体机制有待进一步研究。研究意义PCSK6和furin虽然同属PCs家族,但在RA的关键致病因子之一FLS细胞的生物学功能中的影响却不同。其中涉及的发病机制极其复杂。需要我们的进一步研究。因此PCs家族可能成为RA的新的研究热点,以期在RA的发病机制和治疗中寻找关键靶点。