目的：　　 重金属铅是一种普遍存在的环境神经毒物，即使是低水平暴露，仍然可以损害发育中的中枢神经系统，影响学习记忆能力和神经行为。研究表明：由于婴幼儿的神经系统处于快速发育和完善时期，血脑屏障发育未完善，对铅毒性尤为敏感，儿童铅中毒往往要比成人更常见和严重。发育早期(怀孕期和哺乳期)铅暴露所产生的中枢神经系统的损伤可能持续到成年阶段。婴幼儿、学龄前儿童的血铅水平与IQ值显著相关，血铅水平越高，智商水平越低。当婴幼儿血铅水平达100μg/L时，便可导致患儿学习记忆能力降低和神经行为异常，如智力低下、反社会行为、注意缺陷的多动症和精神分裂症等，而且一经损害即不可逆，其机制还在探讨之中。　　 精神分裂症断裂因子1(Disrupted in scherophernia-1，DISC1)是精神分裂症和其他情绪障碍疾病的易感基因，DISC1基因最初是在对一个苏格兰广谱精神病家系的遗产分析中发现的，定位在1号染色体的1q42区域，有13个外显子，长约200kb，编码一种含有854个氨基酸残基的多功能蛋白质。DISC1调节胚胎和成熟神经发生的多个方面，是成熟海马神经元整合过程中的重要调节元素，DISC1敲除会导致新生神经元迁移增加、细胞肥大、树突分支增多、突触形成增加及电生理特征的异常。破坏DISC1基因对海马体中神经元的发育和迁移有重要影响，海马体是大脑中负责学习和记忆的区域，海马体异常或可能导致智力低下、多动症和精神分裂症。由于铅和DISC1重叠的生理和病理生理功能，我们探讨是否DISC1参与铅的神经毒性。　　 蛋白激酶B(Protein kinases B，PKB)信号通路对干细胞的功能，包括基因的表达，细胞分裂周期进程，细胞生长和分化都起着重要的调控作用。近期的研究表明，PKB与成熟海马的齿状回有丝分裂后期的形态发生及突起的发育密切相关。雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)作为PKB下游的一个效应分子也与神经元的分化、生长及整合密切相关。Enomoto等人发现DISC1可与肌动蛋白结合蛋白Girdin共同调节神经元轴突的形成。之前有研究表明Girdin是PKB的底物，与正常细胞结构的形成相关。Kim等人发现在成年海马的新生神经元中抑制DISC1，会导致PKB过度活化，而这一损伤可被PKB信号通路的下游mTOR的抑制剂雷帕霉素所减弱。同时，研究表明PKB/mTOR信号通路参与铅对海马神经元的损伤。因此，我们推测DISC1可能通过对PKB/mTOR信号通路活性的调控参与铅的神经毒性作用。　　 目前研究表明铅暴露会导致学习记忆损伤及相关神经系统疾病，其可能通过影响神经细胞中某些重要蛋白的相互作用，导致神经元成熟、神经迁移、轴突生长等异常，进而导致疾病。海马是大脑学习和记忆的关键部位，同时也是铅暴露的主要靶点。因此，本研究以学习记忆的核心海马神经元为研究对象，利用体内和体外两个模型，观察重金属铅对海马神经元功能及形态的损伤，探讨在此过程中DISC1蛋白表达水平的变化及其引起细胞毒性的可能机制，及与PKB/mTOR信号转导通路之间的关系。旨在寻找重金属铅对神经系统损伤的分子机制，以期揭示铅中毒等神经疾病的病因学基础，为临床预防和治疗铅中毒及其他神经系统疾病提供一定的实验依据。　　 方法：　　 1、通过石墨原子吸收法对不同浓度铅暴露的模型小鼠进行血铅含量检测。　　 2、通过水迷宫行为学实验对慢性铅暴露小鼠模型进行评价。　　 3、通过RealTime PCR法、Western blot法、免疫组化检测DISC1 mRNA及蛋白表达水平的变化。　　 4、通过免疫荧光检测铅暴露对海马神经元的损伤。　　 5、通过噻唑蓝(MTT)比色实验检测SH-SY5Y细胞的增殖情况，并绘制细胞生长曲线，筛选铅的细胞毒性剂量。　　 6、通过siRNA干扰的方法改变SH-SY5Y细胞DISC1表达水平。　　 7、通过荧光素酶报告基因检测染铅对SH-SY5Y细胞中DISC1基因启动子区活性中的影响。　　 结果：　　 1、慢性铅暴露对小鼠血铅的影响：　　 各慢性染铅组小鼠血铅含量均明显高于对照组，升高的程度有与饮用水的铅浓度呈正相关。当饮用水的铅浓度为0.1mM/L(中剂量组)时，血铅浓度就已经超过了影响学习记忆能力的阈值(10μg/dL)。　　 2、慢性铅暴露对小鼠寻找平台潜伏期的影响：　　 水迷宫实验表明，中剂量组(0.1mM/L)、高剂量组(1mM/L)醋酸铅组所用的时间均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，而低剂量组(0.01mM/L)与对照组比较，无明显差异。结果表明慢性铅暴露可明显损伤小鼠的空间学习记忆能力，随血铅的浓度升高，空间学习记忆损伤程度越严重。　　 3、慢性铅暴露对原代培养的海马神经细胞的影响：　　 10μM的醋酸铅处理原代培养的海马神经细胞14d，导致神经细胞突起结构完整性受损，生长受抑制。　　 4、铅对SH-SY5Y细胞增殖的影响：　　 MTT检测结果显示，与对照组细胞相比，10μM/L和100μM/L PbAc溶液对SH-SY5Y细胞的增殖有着不同程度的抑制作用。而且随着PbAc剂量和给药时间的延长，细胞抑制率逐渐升高。　　 5、铅对DISC1mRNA表达的影响：　　 (1)我们采用SYBRGreen实时荧光定量PCR方法，对铅暴露体内模型中的DISC1mRNA水平的检测发现：与对照组相比，铅暴露使DISC1 mRNA表达水平逐步增高。0.1mM/L和1mM/L PbAc组DISC1 mRNA表达水平比对照组分别升高了8.681和10.063倍。　　 (2)我们采用SYBRGreen实时荧光定量PCR方法，对铅暴露体外模型中的DISC1 mRNA水平的检测发现：与对照组相比，铅暴露使DISC1 mRNA表达水平逐步增高。1.0μM/L和10μM/L PbAc组DISC1 mRNA表达水平比对照组分别升高了2.107和5.972倍。　　 (3)RT-PCR结果显示，SH-SY5Y细胞给予0.1～100μM/L不同浓度PbAc溶液。与对照组相比，细胞DSIC1 mRNA表达水平逐渐增高。1、10、100μM/L组DISC1mRNA表达水平比对照组分别升高了1.96、2.09、2.38倍。　　 6、铅对DISC1蛋白表达的影响：　　 (1)通过WesternBlot的方法，对铅暴露体内模型中的DISC1蛋白水平的检测发现：与对照组相比，0.1mM/L和1mM/L PbAc组DISC1蛋白表达水平明显高于对照组，分别比对照组升高了34％和45%。　　 (2)通过WesternBlot的方法，对铅暴露体外模型中的DISC1蛋白水平的检测发现：与对照组相比，10μM/L PbAc组DISC1蛋白表达水平较对照组升高明显，比对照组升高了2.45倍。　　 (3)给予0.1-100μM/L PbAc溶液作用于SH-SY5Y细胞。通过WesternBlot的方法，对染铅SH-SY5Y细胞中的DISC1蛋白水平的检测发现：与对照组相比，10μM/L和100μM/L组DSIC1蛋白表达水平明显升高，分别比对照组升高了2.89、3.15倍。　　 7、免疫组化检测铅对小鼠海马蛋白DISC1表达的影响：　　 实验组和对照组海马各区细胞均有免疫组化反应阳性颗粒分布，阳性表达呈黄棕色。着色部位主要集中在细胞核，胞浆少量着色。实验组小鼠与对照组相比，海马区阳性细胞数和平均光密度值均有显著差异。实验组小鼠海马DISC1表达均显著高于对照组。　　 8、铅对PKB/mTOR信号通路的影响：　　 (1)WesternBlot结果显示，在体外模型中，与对照组相比，PKB蛋白总量(t-PKB)表达无明显变化。磷酸化PKB(p_PKBSer473)是PKB的活性形式，铅呈剂量依赖性降低PKB活性，即p-PKB表达量随着铅暴露的浓度升高而降低。与PKB一致，mTOR蛋白总量(t-mTOR)表达无明显变化。磷酸化mTOR(p-mTOR)是mTOR的活性形式，铅呈剂量依赖性降低mTOR活性。　　 (2)WesternBlot结果显示，在体内模型中，与对照组相比，t-PKB表达无明显变化，10μM/L PbAc组p-PKB表达量降低明显；1μM/L和10μM/L PbAc组p-mTOR表达量降低明显。　　 9、调整DISC1表达水平对染铅SH-SY5Y细胞PKB/mTOR信号通路的影响：　　 Western blot结果显示，与空质粒对照组相比，转染DISC/siRNA质粒的SH-SY5Y细胞组较单纯染铅组的PKB蛋白表达量无明显变化，但可以在一定程度上提高PKB的磷酸化水平。与PKB一致，下游信号分子mTOR的蛋白表达量也无明显变化，磷酸化水平有所提高。　　 10、调整DISC1表达水平对染铅SH-SY5Y细胞生长的影响：　　 10μM的醋酸铅处理SH-SY5Y细胞，导致神经细胞神经突起结构完整性受损，生长受抑制。转染DISC1siRNA质粒的SH-SY5Y细胞，能够在一定程度上减弱铅对SH-SY5Y细胞生长的损伤。　　 11、铅对SH-SY5Y细胞DISC1基因启动子区活性的影响　　 荧光素酶报告基因的分析结果显示，转染PGL3空载体和PGL3-D/SC/promoter质粒的相对荧光值均升高，但与对照组相比，PbAc组相对荧光值升高明显，说明染铅使DISC1基因启动子区活性增强。　　 结论：　　 1、慢性铅暴露可明显损伤小鼠的空间学习记忆能力，随着血铅浓度的升高，空间学习记忆损伤程度越严重。　　 2、慢性铅暴露导致原代培养的海马神经元突起结构完整性受损，生长受抑制。　　 3、慢性铅暴露可在体内、外模型中均提高DISC1 mRNA及蛋白表达，并且降低PKB/mTOR信号通路活性。　　 4、一定浓度的铅可显著促进SH-SY5Y细胞DISC1 mRNA及蛋白表达，并可通过对PKB/mTOR信号通路的调控影响神经突起结构的形成。　　 5、铅暴露可通过影响DISC1基因启动子区的活性对DISC1的表达进行调控。