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目的通过观察解冻后移植卵巢的存活、发育及内分泌功能,探讨快速冻存法冻存新生大鼠卵巢器官的效果,以及冻存对卵巢抗原性的影响。为今后临床胎儿卵巢冻存后异体移植提供有用的实验室技术及科学依据。方法卵巢取自出生一天的雌性大鼠(新生鼠)和成年雌性鼠。(1)卵巢的低温冻存:低温保护液:A液含1.5M丙二醇; B液含1.5M丙二醇(PROH)+0.1M蔗糖;解冻液(C液)含0.5M蔗糖。冷冻方法为快速冻存法,采用两步渗透平衡法将卵巢依次在A液和B液中渗透平衡各30min,液氮蒸气中冷平衡5min后投入液氮保存。(2)冷冻效果的观察:冻存1~7d后,采用快速法解冻,冷冻效果的观察采用卵巢异体异位移植及超微结构观察。卵巢移植:将受体(成年雌性大鼠)随机分为三组:新鲜卵巢移植组、冷冻卵巢移植组及对照组;新生鼠卵巢及成年鼠卵巢组织均植入去势雌性大鼠的肾被膜下。通过下列指标进行活力判断,①动情周期的观察:移植5d起对各组大鼠阴道脱落细胞进行检查,以判断动情周期是否恢复及维持情况。②组织学观察:于动情周期恢复后取存活的移植物进行常规HE染色,观察存活的卵巢组织形态结构;酶组织化学染色了解3β-羟甾脱氢酶的活性及分布;③采用放射免疫学技术测定血清雌激素水平,对移植后卵巢组织内分泌功能进行量化判定。④利用免疫组织化学方法观察移植物内CD8~+和CD4~+T淋巴细胞的浸润情况。超微结构观察:用透射电子显微镜观察冷冻—解冻后卵巢组织的超微结构。结果(1)动情周期恢复情况:新生鼠卵巢和成年鼠卵巢组织冷冻移植后受体动情周期恢复所需天数分别为27.50±6.72和28.78±4.30明显长于各自的新鲜移植组(14.60±4.84;13.55±2.81)(P<0.01),但各冷冻移植组间及各新鲜移植组间动情周期恢复所需天数无显著性差异(P>0.05)。新生冷冻组和成年冷冻组动情周期恢复率分别为66.67%和75.00% ,低于各自的新鲜移植组(90.51%;91.67%),但二者之间无显著性差异(P>0.05)。(2)组织学观察:各移植组40-45d左右取材时,肉眼可见移植卵巢体积明显增大,移植物表面毛细血管丰富,柔软;光镜下可见存活的移植物内毛细血管丰富,可见到与正常对照组相似的不同发育阶段的各级卵泡,并可见间质腺及一些闭锁卵泡。与40-45d相比, 70d左右取材时,成年鼠新鲜移植组移植物体积变小、苍白,表面毛细血管稀少,质地变硬;光镜下结缔组织较多,生长卵泡较少,闭锁卵泡增多。其它各组肉眼无明显变化。酶组织化学切片中可见存活的移植物中3β-羟甾脱氢酶阳性细胞呈蓝色,其中间质腺及卵泡膜细胞呈强阳性,颗粒细胞呈弱阳性。(3)血清雌二醇:正常对照组雌二醇值为34.76±13.53 pmol/L,各移植组间及移植组与正常对照组间无显著性差异,均明显高于去势对照组(2.96±1.46pmol/L)(P<0.01)。(4)免疫组化观察:新生鼠冷冻移植组CD8~+和CD4~+阳性细胞计数值分别为9.60±6.29和10.00±5.16,明显低于各新鲜移植组(P<0.01)及成年冷冻移植组(28.40±14.52;18.80±9.03)(CD8~+P<0.01,CD4~+P<0.05);但新生鼠新鲜移植组CD8+和CD4~+阳性细胞计数值与成年冷冻移植组间无显著性差异,但它们明显低于成年新鲜移植组(68.00±20.32;40.60±14.39)(P<0.01)。超微结构观察:冻存后的卵巢组织与新鲜未冷冻卵巢组织的超微结构无明显差异。电镜下大部分冻存后的卵巢组织细胞超微结构保持完好,卵母细胞清晰完整,内质网、线粒体形态正常,细胞连接清晰可见。结论①快速冻存法可有效地冻存新生鼠的卵巢,冻存卵巢异体异位移植后行使卵巢功能的时间与成年卵巢组织冷冻后移植的功能恢复时间相比无显著滞后现象。②免疫组化显示新鲜卵巢组织异体移植后新生鼠移植组T淋巴细胞浸润数较成年移植组少,而冷冻后进一步减少。从而间接表明,新生鼠卵巢组织抗原性较低,经冻存后抗原性进一步降低。这一结果为胚胎组织器官的临床应用提供了有用的方法和科学依据。