研究背景:结核病是由结核分枝杆菌感染引起的最常见的肺部流行性疾病之一,我国目前仍是全球结核负担最重的国家之一,耐药结核高发对卫生安全构成严重的威胁。目前诊断结核的手段存在特异性及敏感性不高、耗费时间长等缺点,成为早期诊断、早期治疗、根除传染源并切断传播途径的主要障碍。探索可以早期诊断且具有高度敏感性及特异性的生物标记物对阻断结核传播乃至消灭结核意义重大。miRNA作为一种进化高度保守的内源性的非编码微小RNA(microRNA,miRNA),对基因表达的调控已经被广泛应用于多种传染病的研究。miRNA通过识别、结合靶基因mRNA的互补序列,或通过阻断mRNA的翻译,或促进其降解发挥生物学效应,成为转录后基因表达水平上的关键调节因子。单个的mRNA接受多个miRNA的调控,同时单个miRNA调控多个mRNA,并且不同miRNA之间的相互作用决定最后的生物学效应,因而呈现出复杂的基因调控网络。病原体侵入人体细胞后可以引起细胞miRNA的表达发生快速改变。活动性结核患者外周血单个核细胞(PBMC)、血清及痰液中miRNA表达,与健康人群相比存在显著差异并且已经被多个研究所证实,从而提示miRNA具有作为活动性结核病生物标记物的潜能。进一步的研究证实,多药耐药(MDR)结核与抗生素敏感的结核株miRNA存在显著的表达差异,为耐药结核菌的筛选提供了新的思路。同时,活动性结核病患者在接受抗结核药物治疗前后,部分miRNA在CD4+T细胞中的表达有明显升高。以上提示,miRNAs既可以作为诊断结核病的潜在生物标记物,还可以帮助评估治疗后的恢复情况。反转录定量实时PCR(qRT-PCR)是分析miRNA最为常用的方法,采用杂交的方法从固定在微阵列平台上的DNA捕获探针,根据荧光信号的强度可以量化评估单个miRNA的表达。循环血清或血浆miRNAs可以用于多种传染性疾病的诊断,而结核病是最早采用该方法的疾病之一。miRNAs通过调节人体-结核菌的相互作用,参与结核感染的进程。目前多种计算机网络技术让研究者可以轻松地将实验数据与结核病miRNA和mRNA转录组数据进行分析比对。生物信息学的进步使得探索新型具有免疫调节的miRNA及其作为诊断肺结核的生物标记物成为可能。本研究中从开放的结核菌miRNA与mRNA数据集中筛选差异表达的mRNAs(DE-mRNAs)和 miRNAs(DE-miRNAs),运用计算机网络工具构建 miRNA功能注释网络、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和miRNA-基因-免疫过程(MGIP)网络来检测其与结核病的关系。从筛选结果中根据对靶基因mRNAs表达的作用强度选择8个去调节的miRNAs进行定量实时PCR(qRT-PCR)验证,并与健康对照组进行比对验证,同时使用ROC曲线评价其诊断性能,探索可以应用于诊断活动性结核的生物标记物。材料与方法:从国家生物技术信息基因表达综合中心(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载结核病mRNAs和miRNAs表达的原始数据集GSE2910和GSE54992,分别使用R limma软件包及Affy软件包进行数据预处理。使用Benjaminifi Hochberg(BH)程序和错误发现率(FDR)处理原始p值,采用T检验筛选活动性结核(ATB)和健康供者之间的差异表达的miRNAs和mRNAs。采用GO功能分析、KEGG途径富集分析和在线DAVID方法,对已经筛选出的的DE-mRNAs进行分析。用R脚本绘制显示明显富集的生物学过程、细胞组分、分子功能以及通路的图形,完成DE-mRNAs的功能注释和富集。将相应的蛋白名称上传至String数据库,导出蛋白质-蛋白质相互作用数据并用Cytoscape打开;MCODE v.1.4.2用于识别密集连接的基于拓扑的群集子网络;CentiScape v2.2 8pug-in计算节点中心性并找出重要模式;ClueGO v2.3.5 9程序用于注释和丰富DE-mRNA和通路之间的显著(p<0.05)连接;完成蛋白质间相互作用(PPI)与基因免疫通路网络构建。使用microT-CDS预测miRNA靶标,根据DE-miRNAs的反向倍数变化趋势和相应的预测DE-mRNAs,筛选配对的DE-miRNAs-DE-mRNA进行网络构建。最后,利用Cytoscape构建了 miRNA-mRNA靶向、反向表达趋势和mRNA-免疫功能的三层网络。通过以上所构建的miRNA功能注释、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和miRNA-基因-免疫过程(MGIP)网络来检测DE-miRNAs与结核病的关系。从其中选择8个DE-miRNAs进行qRT-PCR验证。使用一步细胞分离法细胞制备管(CPTs)采集活动性结核病患者与健康对照组各30例的血样。使用miRNA分离试剂盒从人外周血单个核细胞中提取RNA;NanoDrop分光度计测定提取的RNA纯度,A260/A280比值为1.8-2代表纯RNA。每个RNA样本中200ng使用TaqMan(?)microRNA反转录试剂盒用于qRT-PCR的合成。miRNA qRT-PCR 使用 miDETECT A Track 150TM miRNA 定量实时起始试剂盒,20μl反应40个循环。用△CT法对miRNA的CT值进行处理;采用医学绘图统计软件Graphpad prism 6.0进行数据分析,数据表示为x±s;组间比较采用t检验,p<0.05为差异有统计学学意义。应用ROC曲线分析AUC、临界值(cut-off)、敏感度、特异度等指标评价DE-miRNAs的诊断价值。结果:共筛选出7463个DE-mRNAs和38个DE-miRNAs。功能注释确定了 MAPK信号通路和白细胞迁移富集的过程。PPI和MGIP网络证实CXCL1、CXCL2趋化因子和受体CCR7的表达水平下调。3个miRNAs(miR-892b、miR-199b-5p和miR-582-5p)在活动性结核患者和健康对照组中表达差异有显著性(p<0.05)。MIR-892b诊断活动性结核为敏感性70%,特异性90%,AUC 0.82。结论:大多数趋化因子和受体在肺结核组中表达下调,提示趋化性受到抑制。活动性结核患者的miR-892b水平较低,miR-892b可能是结核病的诊断性生物标志物。miR-892b作为结核进展的生物标志物需要进一步的研究。