猪链球菌的分离鉴定及2型猪链球菌基因芯片检测技术的试验研究

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猪链球菌病是由链球菌感染所引起的猪的一类疾病的总称。该病分布范围极广,世界各地均有发生。自20世纪5O年代初期证实以来,荷兰、英国、美国等世界许多国家先后报道了猪链球菌病。由于链球菌血清型众多,抗原结构复杂,该病严重影响各国养猪业的发展,尤其是对高密度的养猪场危害更大,给养猪业造成了巨大的经济损失,受到越来越多的重视。近几年,我国猪链球菌病的发生和危害日趋严重,除西藏等少数地区尚未发现该病外,大多数省、市、自治区均有不同程度的发生与流行,并引起从业人员感染和死亡,严重威胁了人类公共卫生,因此建立一种新型、快速、准确的猪链球菌检测方法就尤为重要。基因芯片是生物技术与电子芯片融合的结晶,是由固定于固相载体表面的核苷酸阵列构成的一种新型微型器件,通过设计针对目的基因的探针,与被检测基因的碱基序列互补匹配,可快速、准确地检测到目的基因,用于动物疫病的诊断。由于其快速、微量、准确的应用优点,正在成为新一代的自动化疫病检测工具。本研究采用微生物学、血清学、PCR扩增和序列测定相结合的方法,对病料中的猪链球菌进行分型鉴定,为实施科学有效的猪链球菌防控措施提供依据。本研究通过2型标准菌株特异性探针制作基因芯片,将被检样品在PCR过程中用Cy3标记,得到的DNA产物与芯片杂交,达到检测2型链球菌的目的,建立2型猪链球菌基因芯片检测方法;同时通过研究不同靶探针浓度和杂交时间等对检测结果的影响,确立最佳反应条件为42℃水浴锅中温浴30min,探针浓度在5μM/L时即可得到较好的杂交信号;本研究制备的猪链球菌2型基因芯片,可以成功地检测到猪链球菌2型特异区基因,荧光信号清晰,敏感性高,实际应用效果好,是一种检出率高的诊断方法。该方法不仅为实现多种病原体在同一张芯片上进行检测奠定基础,同时也为其他致病菌应用基因芯片方法检测提供了理论依据。总之,本研究将基因芯片技术应用于动物疫病的检测,成功建立了2型猪链球菌基因芯片检测技术平台,解决了疫病检测中的难题,具有重大的理论意义和应用价值。为今后利用基因芯片技术开展动物疫情诊断和研究提供理论依据,也为控制和消灭疫情奠定基础。
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