第一部分 肿瘤微环境对CD8+T细胞胆固醇代谢及其抗肿瘤活性的调控作用研究研究背景和目的以T细胞为基础的免疫疗法,包括免疫检查点阻断疗法和CAR-T细胞治疗等方法在恶性肿瘤的治疗中取得了重要突破,然而肿瘤微环境的复杂性限制了免疫疗法的疗效和临床响应率。肿瘤微环境能从多方面抑制T细胞的免疫应答,除了免疫抑制细胞和细胞因子,还能通过代谢调控T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。肿瘤微环境可以重塑T细胞的胆固醇代谢,并影响T细胞的功能,但是其具体机制尚未明确。本文研究目的为探究肿瘤微环境对CD8+T细胞胆固醇代谢通路及CD8+T细胞抗肿瘤活性的调控功能,以期探索新的肿瘤免疫治疗方法。研究方法为了明确肿瘤微环境中胆固醇含量,我们利用免疫组织化学（IHC）技术,检测临床病人的结直肠癌、肺癌、乳腺癌样本组织,以及小鼠MC38细胞盲肠种植模型和B16F10黑色素瘤肺转移模型的肿瘤组织的载脂蛋白B（APOB）含量。随后,在小鼠MC38细胞皮下瘤模型中,我们利用Filipin III标记小鼠脾脏CD8+T细胞和肿瘤浸润CD8+T细胞的游离胆固醇,再运用激光共聚焦成像技术来检测细胞胆固醇水平。为了更好地研究T细胞在肿瘤中的胆固醇代谢通路的变化,我们在Rag2基因敲除小鼠上种植MC38细胞皮下瘤,接着取OT-I转基因小鼠的脾脏细胞培养、分化为成熟的杀伤性CD8+T细胞（CTL）,再利用尾静脉注射将CTL细胞过继转移到荷瘤小鼠中,并分别在注射第3天和第7天分离纯化出肿瘤浸润CD8+T细胞（CD8+ TILs）。通过荧光定量PCR（qPCR）技术检测OT-I小鼠脾脏中分离出的na?ve CD8+T细胞、CTL细胞和CD8+TILs中与胆固醇代谢通路相关基因的转录水平,同时运用流式细胞术（FC）检测分析肿瘤浸润CD8+ T细胞表面的低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor,LDLR）水平以及LDLR敲除小鼠模型中CD8+T细胞的免疫功能相关指标。最后,我们将LDLR过表达的CTL细胞过继转输到Rag2基因敲除的免疫缺陷荷瘤小鼠中检测肿瘤生长情况以探究LDLR对肿瘤浸润CD8+T细胞抗肿瘤活性的影响。研究结果在结直肠癌、肺癌、乳腺癌样本和小鼠MC38肿瘤种植样本、B16F10肺转移癌样本中,LDL/胆固醇含量要比正常组织多,而在肿瘤浸润CD8+T细胞中胆固醇含量相比正常脾脏细胞显著减少。在肿瘤浸润CD8+T细胞中胆固醇合成相关基因表达下调,而CTL浸润到肿瘤微环境后LDLR转录水平下降。LDLR敲除的CD8+T细胞增殖与效应功能被抑制,LDLR敲除阻碍免疫突触形成并抑制CD8+T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性;LDLR过表达显著增强CD8+T细胞在体内外的抗肿瘤活性。研究结论肿瘤微环境中富含胆固醇,但肿瘤浸润CD8+T细胞的胆固醇摄取被抑制。LDLR会内源性地调节肿瘤浸润CD8+T细胞的免疫应答和抗肿瘤活性。第二部分 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的代谢基因筛选文库构建研究背景和目的基于CRISPR/Cas9的基因敲除技术是正向遗传学筛选中一种强大而精准并能把特定表型相对应的遗传因素与生物现象直接联系起来的方法,基于该技术构建的各种基因敲除文库已广泛应用于细胞凋亡基因筛选、耐药基因筛选、肿瘤功能基因筛选等。本文目的为通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,利用双质粒系统构建脂质和线粒体代谢相关基因的筛选文库,为之后在结肠癌细胞中筛选肿瘤生长调控基因、耐药基因等作准备。研究方法运用聚合酶链式反应（PCR,Polymerase chain reaction）获取蓝色荧光蛋白（BFP,Blue fluorescent protein）目的基因,再通过无缝克隆技术（Seamless Cloning）重组到质粒LentiGuide-puro载体中,构建LentiGuide-BFP载体。合成靶向脂质和线粒体代谢相关基因的sgRNA Oligo,并将其克隆到LentiGuide-BFP载体中,从而获得目的基因的敲除文库。利用病毒感染方法构建表达Cas9蛋白的小鼠结肠癌细胞稳转株,并通过蛋白免疫印迹（Western Blot）检测Cas9蛋白表达,随后利用靶向Pdcd1基因的sgRNA载体验证Cas9蛋白的功能。研究结果我们构建了带有标记荧光蛋白的筛选载体质粒LentiGuide-BFP和表达cas9蛋白的小鼠结肠癌细胞稳转株,并构建了靶向脂质和线粒体代谢相关基因的sgRNA筛选文库。研究结论成功构建出带蓝色荧光蛋白标记的LentiGuide-BFP重组载体,并构建了靶向脂质和线粒体代谢相关基因的sgRNA筛选文库;同时构建了表达cas9蛋白的小鼠结肠癌细胞稳转株。