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目前应用DNA载体介导的RNAi技术是向细胞内引入小干扰RNA(siRNA)简单、经济、有效、安全的方法。目前载体中常用的启动子类型主要有两大类:RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)识别的启动子和RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)识别的启动子。RNA聚合酶Ⅲ类启动子(PolⅢ)可以表达过量的siRNA,诱导高效率的基因沉默。但这类启动子缺乏细胞特异性和过量表达siRNA会增加脱靶效率以及引起非特异性作用如干扰素反应和细胞毒性等。与RNA聚合酶Ⅲ类启动子(PolⅢ)相比, RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)启动子具有细胞和组织特异性,许多内源性的microRNA(miRNA)也是由其调控的。因此,模拟天然miRNA来表达调控siRNA ,是进行RNAi的一种行之有效的策略之一。但有研究表明用RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)启动子模拟miRNA来直接调控siRNA其沉默效率还不如RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子直接调控的siRNA沉默效率高。因此,尝试应用RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子表达长双链RNA来实现对靶基因组织特异性高效沉默也是一个很重要的研究领域。长双链RNA在细胞核内能够被Dicer等加工成21-23bp长的siRNA,出核后可产生siRNA的效应,且其具有针对多位点产生干扰效应的特点,干扰效率会更高,其不会产生脱靶效应。更重要的是其更适合由RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子来调控,这一特点使得这一技术更适合于通过转基因技术制作组织和发育阶段特异性沉默特定不利基因而达到改良畜产品品质的目的。如牛乳因其来源广泛、营养丰富且与人乳成分较为接近而长期用作母乳的代用品,但牛乳中的alphaS1酪蛋白和beta-乳球蛋白是引起饮用牛奶的婴幼儿消化不良和产生过敏反应的主要成分。如果能够通过转基因的方法制作在泌乳期乳腺上皮细胞中特异性表达两种蛋白基因的长双链干扰RNA,并有效将两个基因进行沉默,这将能够有效改变牛奶成分使之更适合婴幼儿饮用,在当今大家畜基因敲除技术还很不成熟的情况下这一思路就具有了更高的可行性。但是RNA聚合酶Ⅱ启动子(PolⅡ)转录产物主要为mRNA的前体分子hnRNA,hnRNA经过加工后会被立即转移到细胞质。有研究表明长度大于30bp的双链RNA在细胞质中会引起干扰素反应。因此,使用RNA聚合酶Ⅱ启动子表达长双链RNA来实现RNA干扰存在的一个问题就是如何实现在长双链RNA被加工成短的(小于30bp)的双链RNA之前,使之被有效的限制在细胞核内而不进入细胞质从而避免其引起干扰素反应。本研究探索了在哺乳动物细胞中有效避免干扰素反应,应用RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子(PolⅡ)来表达长dsRNA进行RNAi的可行性。主要开展了以下方面的研究:以pCDNA3.1(+)载体为基本骨架,在其转录单元的5’端添加了一个自剪切的HDV核酶用于切掉转录后的5’帽子和其基因编码序列的3’端添加了一个自剪切的烟草环斑病毒发夹状核酶用于将3’polyA切掉,又在发夹状核酶下游添加了一个加尾信号BGHpA(牛生长激素加尾信号)。为了更加保险的防止通读现象的发生在BGHpA加尾信号下游添加了一个自我剪切的烟草环斑病毒核酶和能够延缓RNA聚合酶Ⅱ转录的人β-actin基因(Humanβ-actin gene)减速序列。为以后用G418筛选得到稳定表达长双链干扰RNA的细胞系,又将整个结构转移到已经改造好的装有新霉素抗性基因(Neomycin)表达结构的的pBluescriptⅡSK (+)载体中。为初步检测该载体的功能,在该载体中插入增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)作为报告基因,通过转染PK15细胞来观察绿色荧光蛋白基因的表达情况,对该载体的功能进行初步的判断。在实验中设立了对照组(表达eGFP的常规载体),进行PK15细胞转染。为排除载体大小对转染效率的影响,实验中使用的对照载体比实验载体略大,同时为了排除质粒制备及转染过程对实验的影响,我们又构建了一个表达红色荧光蛋白的载体分别与这两组载体做共转染,以红色荧光指示这两组的转染效率。结果在转染效率相同的情况下,对照组能观察到绿色荧光,而实验组没有观察到绿色荧光,初步显示实验载体能够达到预期效果。随后,应用半定量RT-PCR检测了各组之间细胞质中eGFP的mRNA差异。结果实验组比对照组下降了46.1%,因此该载体在抑制mRNA出核上起到了一定的效果。总之,本研究设计并构建了一个意在将表达的mRNA限制在细胞核内,能够在用于表达长双链RNA时有效避免长双链RNA出核引起干扰素反应的载体系统,并在细胞水平和RNA水平上对其功能进行了评价。初步获得了一个能够降低mRNA出核的载体系统,为进一步对该载体系统进行改进,将来真正应用于表达长双链干扰RNA并能有效避免其引起干扰素反应的研究奠定了一定的基础。