普通牛与牦牛的杂交后代称为犏牛,在杂交后代中母犏牛具有正常繁殖能力,但F1～F3代公犏牛都不具有生育能力,无法产生精子。迄今为止,有关犏牛雄性不育的分子机制还没有明确的结论。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(KDMs)可能影响组蛋白的甲基化水平,而在精子发生过程中发挥重要作用。本研究的目的是探讨KDMs家族中的KDM1A和KDM4B两种去甲基化酶在犏牛雄性不育中的可能作用。实验材料为性成熟的成年牦牛(n=10)和杂交一代犏牛(n=10)。将性成熟的牦牛和犏牛附睾制成石蜡切片,经染色后在显微镜下观察附睾的组织结构;从睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了KDM1A和KDM4B的编码序列(CDS),并分别用定量PCR和Western blotting检测牦牛和犏牛睾丸中KDM1A和KDM4B的m RNA和蛋白水平;利用ELISA方法比较了牦牛和犏牛睾丸中H3K36me3和H3K27me3的组蛋白甲基化修饰水平。本研究获得的主要结果如下:(1)牦牛和犏牛附睾切片在镜下观察,在牦牛附睾管中存在大量精子,而犏牛附睾管中不存在精子。(2)牦牛睾丸KDM1A的测序结果显示两个剪接体,与普通牛类似,其中KDM1A剪接体1的CDS为2622 bp,编码873个氨基酸,而剪接体2的CDS为2562 bp,编码853个氨基酸。与剪接体1相比,剪接体2缺失一段60 bp长度的片段,其余序列相同。与普通牛KDM1A基因两种剪接体相比,牦牛KDM1A基因两种剪接体在CDS中均有5个核苷酸差异,但对应的氨基酸序列完全一致。KDM1A基因剪接体1的CDS与普通牛(99.81%)、野牦牛(99.50%)、羊(97.75%)、猪(93.77%)、狗(93.29%)、马(93.60%)等6种动物KDM1A基因有93.29%～99.81%的序列一致性。KDM4B基因的CDS长度为3351 bp,编码1116个氨基酸。与普通牛相比,牦牛KDM4B序列中间缺少一个25个氨基酸的片段,有28个核苷酸差异,并导致9个氨基酸不同。KDM4B基因序列与普通牛(99.07%)、野牦牛(97.94%)、羊(96.84%)、猪(90.95%)、狗(88.46%)、马(87.74%)等6种动物具有87.74%～99.07%的序列一致性。这些结果说明牦牛KDM1A和KDM4B基因均较保守。(3)采用实时定量PCR方法检测牦牛和犏牛睾丸中KDM1A和KDM4B的m RNA水平。结果表明,与牦牛相比,犏牛睾丸中KDM1A和KDM4B基因的相对m RNA水平均极显著降低(P<0.01)。采用Western blotting检测KDM1A和KDM4B蛋白在牦牛和犏牛睾丸中的表达,结果显示,两种蛋白在犏牛睾丸中的表达也极显著低于在牦牛睾丸中的表达(P<0.01)。(4)ELISA结果显示,与牦牛相比,犏牛睾丸中H3K36me3的水平显著降低(P<0.05),但H3K27me3的水平没有显著差异。以上结果表明在犏牛精子发生过程中,精子发生可能受到了KDM1A的m RNA和蛋白水平以及组蛋白H3K36三甲基化水平的影响。本研究结果为进一步从表观遗传学角度解释犏牛雄性不育的分子机制提供了新的资料。