前言　　 胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一,其发病率以及死亡率也在逐年增加。胃癌很多是从慢性胃粘膜病变(慢性萎缩性胃炎,肠上皮化生,异型增生)演变而来,而其演变的机制依然不明。因此,从分子水平上,尤其是基因的结构和功能上研究胃癌的发生机理,不仅有助于认识胃癌的病因,而且有利于提高临床诊疗水平。　　 p53是第二个被发现的,同时也是最重要的抑癌基因。由于其在维护多细胞生物体基因组稳定性方面发挥了无可取代的功能,因此被赋予“基因组卫士”的称号。在p53被发现之后的20年中,研究者始终未能发现p53同源基因存在,因此p53一直被作为一个单独的基因而不是作为某个基因家族的一员来看待。直到p73和p63的发现,人们才逐渐开始以全新的观点认识p53基因家族。作为p53家族的最新成员,p63在序列和结构上与p53具有高度的同源性,由于p63受两个不同的启动子操控,因此形成两种主要的亚型,即TAp63和△Np63。而转录后由于选择性剪接过程又产生了α,β,γ三种亚型蛋白。P63的各种亚型蛋白具备不同的结构和生物学功能,并且在人体各种组织的表达具有明显的差异性,从而导致了p63生物学功能的复杂性。　　 尽管p63是p53家族成员中最晚被发现的基因,但是从序列特点以及结构特征上分析表明其具有不同于p53的独特性。p63的全长序列要比p53长,不仪在其N端具有经典p53的结构域,即转录激活区,同时在C端还有转录抑制结构域,而且还有其独特的SAM结构域。结合p63较p53具有更为广泛的生物学功能这一特点,可以推测在生物进化过程中,p63是最早出现的基因,随着进化的进程,多细胞生物体由于结构和功能的多样化而逐渐演变出了p53基因,后者专门实施维护基因组稳定性的功能。因此,p63很可能是p53基因家族的祖基因。　　 p63基因自1998年发现以来,已经引起了研究人员的广泛关注,而近十年的研究结果也逐渐丰富了人们对p53基因家族牛物学功能的认识。目前,p63基因在发育中的作用已经相对明确,但是p63与肿瘤的关系依然十分模糊,一直无法明确其究竟是癌基因还是抑癌基因。考虑到p63具有多种亚型,而且目前尚没有针对某一种特定亚型的抗体,这给p63的研究增加了较大的困难,很难确定这个p63群体到底在生物体组织中发挥怎样的生物学功能。目前,虽然p63与肿瘤的发生发展关系报道层出不穷,但是其与胃癌的关系的研究报道依然少之又少。已经有文献报道了p63在胃癌组织中的表达水平与分化程度密切相关,但是没有p63亚型与胃癌发生关系的详细报道。本研究通过检测p63两种主要亚型TAp63和ANp63在胃癌细胞系中的表达状况,以及这两种亚型在胃癌细胞中生物学功能及作用机制的异同点,从而为胃癌中p63作用机制的研究积累实验依据。　　 方法　　 1.常规培养5株胃癌细胞株,分别为低分化胃痛细胞株MGC803,AGS,MKN45及中高分化胃癌细胞株SGC7901,MKN28。　　 2.取两例胃大部切除术后的胃正常上皮组织作为对照。　　 3.RT-PCR方法检测胃癌细胞株内p63的两个亚型TAp63及△Np63的mRNA表达水平。　　 4.Northernblot榆测胃癌细胞株内p63的两个亚型TAp63及△Np63的mRNA表达水平。5.Westernblot检测胃癌细胞株内p63的两个亚型TAp63及△Np63的蛋白表达水平。　　 6.构建TAp63α及ANp63α的真核表达载体pEGFP-N1-rAp63α,pEGFP-N1-△Np63α。　　 7.分别用pEGFP-N1-TAp63α,pEGFP-N1-ANp63α转染MKN28胃癌细胞系,从而构建TAp63α及ANp63α的高表达细胞系。　　 8.合成TAp63及△Np63的siRNAoligo。　　 9.分别将TAp63及△Np63的siRNAoligo转染入MKN28胃癌细胞系,从而构建TAp63及△Np63的基因沉默细胞系。　　 10.MTT方法检测TAp63及△Np63高表达或敲除对MKN28细胞增殖的影响。　　 11.克隆形成实验检测TAp63及△Np63高表达或敲除对MKN28细胞增殖的影响。　　 12.AnnexinV/PI检测TAp63及ANp63高表达或敲除对MKN28细胞凋亡的影响。　　 13.Westernblot检测TAp63及ANp63高表达或敲除对MKN28细胞中GATA-4,GATA-5,GATA-6表达的影响。　　 结果　　 1.p63的两个亚型TAp63和△Np63在胃癌细胞中存在表达,且都以α亚型为主要表达形式。　　 2.TAp63和ANp63在胃癌细胞中的表达特点并不相同。TAp63在正常胃粘膜上皮组织与胃癌细胞系中的表达水平较低,且各种分化程度的胃癌细胞系的表达水平无明显差异;△Np63在正常胃粘膜上皮组织表达水平较高,但是在胃癌细胞系中存在高表达,并且与细胞分化程度相关,即随着分化程度的下降(即恶性度的增高),△Np63表达水平增高。　　 3.TAp63和△Np63在胃癌细胞的表达调控发生在转录水平,即蛋白表达水平与mRNA水平一致。　　 4.TAp63高表达能抑制MKN28细胞的增殖,同时促进凋亡。　　 5.TAp63敲除对MKN28的增殖没有明显影响;在没有凋亡诱导剂存在的条件下,TAp63敲除对MKN28的凋亡也无明显影响。　　 6.△Np63高表达显著促进MKN28细胞的增殖;在没有凋亡诱导剂存在的条件下,△Np63高表达对MKN28细胞的调亡无明显影响。　　 7.△Np63敲除显著抑制MKN28细胞的增殖,同时促进凋亡。　　 8.TAp63和△Np63高表达或敲除对GATA-4或GATA-5的表达无明显影响。　　 9.TAp63高表达抑制GATA-6的表达,而TAp63敲除促进GATA-6的表达。　　 10.△Np63高表达促进GATA-6的表达,而△Np63敲除抑制GATA-6的表达。　　 结论　　 1.p63的两个亚型在胃癌细胞中存在差异表达,与正常胃粘膜上皮细胞相比,胃癌细胞中TAp63表达水甲无明显变化,而△Np63表达水平明显升高,并且与胃癌细胞的分化程度负相关。　　 2.TAp63抑制胃癌细胞的增殖,并促进凋亡,而△Np63促进胃癌细胞的增殖,并抑制凋亡。这提示在胃癌细胞TAp63可能行使抑癌基因的功能,而△Np63可能行使癌基因的功能。　　 3.GATA-6可能是胃癌细胞中p63的靶基因。