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目前,抗体片段Fab在治疗人类多种疾病(如癌症、病毒感染、炎症等)方面起着重要作用。由于其缺少糖基化的Fc区,因此并不需要进行糖基化修饰。此结构特点使得Fab可在大肠杆菌中进行活性表达。Escherichia coli作为宿主菌株的突出优势在于低成本、生长快、易控制,在短时间内可以获得高产量,因此,已逐渐成为生产抗体的中坚力量。但是,在E.coli中生产抗体片段Fab的主要限制因素在于Fab的产量较低,原因主要是Fab易在胞质中错误折叠、聚集,形成无生物学活性的包涵体,且宿主菌中含有多种蛋白酶,对Fab有一定的降解作用等。因此,为提高抗体产量,可以从表达载体、宿主菌株、分子伴侣及折叠酶等几个方面着手,以期达到理想目标。本课题从三方面对Fab的表达进行了优化:1)在实验室前期工作基础上,以E.coli DH11 T7为宿主菌株,通过构建不同的Fab表达载体,最终提高Fab在E.coli中的产量;2)在1)工作的基础上,通过共表达多种分子伴侣,进一步提高Fab在E.coli中的产量;3)在E.coli周质蛋白酶缺陷菌株DHll-ptr-degp(以下简称86D)的基础上,对其基因组上spr(extragenic suppressor,抑制prc基因缺陷造成的菌体过早裂解)基因H145A位进行单个氨基酸突变,获得突变菌株86D-Mspr,同时共表达优势Fab表达载体及分子伴侣,最终通过发酵实验,提高Fab在E.coli中的产量。对于Fab表达载体的构建,主要对信号肽进行优化。尤其是重链信号肽DsbA及STII,通过改变信号肽翻译起始区(translation initiation region,TIR)强度,将获得的13个重链片段分别与PelB-LC连接至pET-3b载体骨架,经ELISA分析获得了Fab最优表达载体的组合DsbA8+HC +Pe1B+LC(pET-DH8PL),总产量约14 mg/L左右。通过进一步构建单一分子伴侣表达载体及多个分子伴侣表达载体,能够在一定程度上改善Fab在E.coli中的分泌表达,尤其当以p15c-FkpA-SurA组合时,Fab产量可达到20mg几左右,产量提高了30%。将宿主菌株由E.coliDH11 T7替换为E.E.coli周质蛋白酶缺陷菌株86D时,抗体片段Fab的产量可提高20%左右。E.coli属于原核表达系统,其发酵工艺相对简单,对表达宿主的大规模培养是为了获得大批量的抗体蛋白。本课题在实验室所构建的Red无痕敲除法的基础上,用类似的方法完成了对E.coli 86DsprH145A单个氨基酸的突变,获得了基因组突变菌株86D-Mspr。第一步,将构建的供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB与辅助质粒pAAICDGBE共转入E.coli 86D中,在L-阿拉伯糖的作用下,诱导表达I-CreI核酸内切酶和Red重组酶。I-CreI酶切割供体质粒上的左右同源臂及Cm抗性基因,并在Red重组酶的作用下,进行同源重组,最终在E.coli 86D基因组上成功整合Cm抗性基因。第二步,将辅助质粒SN3K转化至第一步含Cm抗性基因的E.coli 86D中,同样在L-阿拉伯糖作用下,诱导表达I-SceI核酸内切酶和Red重组酶。在I-SceI酶作用下,将基因组上的Is-Cm片段切除,同样在Red重组酶的作用下,左右同源臂与染色体发生同源重组,从而获得基因组突变菌株86D-Mspr。最终对其进行初步发酵工艺研究,在3 L发酵罐中抗体片段Fab的产量可达到72 mg/L左右。本工作为进一步提高抗体Fab产量打下了基础。