牦牛作为高原地区重要的经济物种,是当地人民赖以生存的生产资料。但其繁殖力低下,很大程度限制了高原地区的经济发展。卵丘细胞作为有腔卵泡中主要的细胞之一,其生长发育对卵巢和卵母细胞的发育起着关键调节作用,故此卵丘细胞功能的研究对于提高哺乳动物繁殖效率有重要意义。SIRT3是组蛋白去乙酰化酶家族的成员之一,目前对它的研究主要集中在基因表达、代谢调控、癌症和衰老等方面,然而对于其在卵丘细胞中的功能知之甚少。本研究拟探讨SIRT3对牦牛卵丘细胞的影响及其分子调控。试验利用RT-PCR技术克隆获得牦牛SIRT3基因序列,并对其进行生物信息学分析,再通过实时荧光定量PCR技术检测SIRT3在各组织中的相对表达量;利用RNA干扰技术,沉默卵丘细胞中SIRT3的表达,通过qPCR技术检测干扰后卵丘细胞中增殖基因(PNCA)、凋亡基因(BAX、BCL-2、P53和CASPASE3)、抗氧化基因(IDH2、MnSOD、CAT和SOD2)和孕酮合成相关基因(StAR、CYP11A1和3βHSD)等基因的相对表达量,结果表明:(1)SIRT3基因的ORF(open reading frame,开放阅读框)为1 002 bp,编码333个氨基酸;生物信息学分析结果显示,SIRT3为碱性不稳定亲水蛋白,无跨膜结构和信号肽;同源性结果显示,SIRT3在进化过程中高度保守;组织表达谱结果说明,该基因在牦牛的各个组织中广泛表达,在脾、睾丸、肺、卵巢和肌肉中的表达较高;(2)成功建立牦牛卵丘细胞体外培养体系,并通过免疫荧光染色技术确定SIRT3在卵丘细胞的细胞质和细胞核中均有表达,主要表达于细胞核中;(3)通过RNA干扰技术成功构建SIRT3沉默后的卵丘细胞模型,干扰效率为86%,干扰SIRT3后,卵丘细胞增殖率显著降低,ROS水平显著上调,孕酮水平显著降低;(4)干扰SIRT3后,促凋亡基因BAX、P53和CASPASE3显著上调,增殖基因PCNA、抗氧化基因IDH2、MnSOD、CAT和SOD2以及孕酮合成相关基因StAR、CYP11A1和3βHSD显著下调。综上所述,牦牛SIRT3基因在物种进化过程中高度保守,在各组织中广泛表达;同时,SIRT3可能通过调节相关基因的表达显著抑制牦牛卵丘细胞的增殖凋亡、ROS产生以及孕酮分泌。本试验为进一步研究SIRT3基因在牦牛生长发育以及牦牛卵丘细胞的增殖凋亡、氧化应激和孕酮分泌中的作用提供基础数据,同时也为研究牦牛雌性生殖的调控以及改善牦牛生产性能提供了一定的依据。