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为了提高山定子(Malus baccata(L.)Borkh)的生根能力,用发根农杆菌转化山定子,诱导产生发根,并由发根再生植株。通过对不同发根农杆菌株系、培养基、共培养时间以及添加乙酰丁香酮(AS)的研究,优化了发根农杆菌转化体系。当用添加AS(100μmol/L)的菌液侵染植株切段30分钟,共培养3d,在无激素的固体1/4MS培养基上诱导发根时,发根诱导率最高,达到88.89%。
发根再生通过两个途径进行:1.诱导愈伤组织获得再生植株;2.发根通过器官发生途径直接再生植株。途经l筛选了三种不同激素组合的培养基,结果表明将发根愈伤组织在MS+BA2.0 mg·L<-1>+HBA0.1 mg·L<-1>+GA<,3>0.1 mg·L<-1>的再生培养基上培养,再生率最高,达到3%。途经2利用L3<4>正交设计对影响发根再生的6-BA、IBA、GA<,3>、TDZ四种激素进行了筛选,结果表明将发根在MS+6-BA2.0 mg·L<-1>+IBA0.5 mg·L<-1>+GA<,3>0.3 mg·L<-1>+TDZ0.5 mg·L<-1>。 (琼脂0.7%,蔗糖3%,pH5.8)的再生培养基上培养,以不没入培养基表面为宜,再生率最高,达到73.3%o再生植株PCR检测得到6株阳性转基因植株,转化效率为10%。为今后利用发根农杆菌转化外源基因奠定基础。
再生植株在MS+6-BA0.2 mg·L<-1>+IBA0.5 mg·L<-1>(琼脂0.7%,蔗糖3%,pH5.8)的培养基上培养,邓肯氏新复极差测验(P=0.05)显示生根率(86%以上)显著高于对照(61%),根量增加,根系发达,生根能力提高。再生植株移栽成活率高,达到95%以上,对照仅为60%。