基于适配体和氯化血红素的比色分析法检测食品中氯霉素和赭曲霉毒素A

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氯霉素(Chloramphenicol,CAP)是一种高效广谱性抗生素,常被非法用于畜牧业生产中,造成食品安全问题。尤其在奶牛泌乳期使用时,会造成牛奶中CAP的残留而危害人体造血功能以及具有致畸形和致癌等危害健康。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种广泛存在于谷物、豆类及水果中的真菌毒素,如果长期摄入被其污染的食品,会在体内积累而危害人体健康。目前CAP和OTA的检测方法存在依靠大型仪器、设备昂贵、操作繁琐、前处理复杂等问题。基于此,本文利用适配体的特异识别能力和氯化血红素的模拟酶特性,分别建立了CAP和OTA的比色分析检测方法,可灵敏、准确、简便地用于食品中CAP和OTA的快速检测。论文包括以下两部分:第一部分,基于适配体的特异识别性能与氯化血红素(hemin)的模拟酶特性,建立了一种比色分析法用于牛奶中CAP的检测。将hemin分别修饰在CAP适配体的3’端及其互补链的5’端,当体系无CAP存在时,两条单链DNA杂交形成双链结构,hemin互相靠近形成二聚体使其过氧化物模拟酶活性降低,无法催化H2O2氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)。而有CAP存在时,CAP与适配体特异性结合,导致双链解离,hemin二聚体解聚形成单体而呈现强的过氧化物模拟酶活性,可催化H2O2氧化TMB,使溶液的颜色从无色转变为蓝色,加入H2SO4终止反应后,溶液呈稳定的黄色,通过测定452 nm处的吸光度即可定量分析CAP的含量。在pH 4.0的HAc-NaAc缓冲体系中,当DNA浓度为0.2μmol L-1、钠离子浓度为100 mmol L-1、TMB和H2O2浓度分别为0.9 mmol L-1和100 mmol L-1时,检测CAP的线性范围为130 nmol L-1(y=0.0199x+1.223),以3倍标准偏差(3S/N,n=10)计算检出限为0.315 nmol L-1,将建立的方法用于牛奶中CAP的检测,加标回收率为95.5%116%,表明该方法可准确、灵敏、快速地检测牛奶中CAP的残留量,说明方法对CAP残留量的痕量检测具有巨大潜力。第二部分,基于适配体与hemin-G-四链体检测食品中OTA。通过设计两条无标记单链DNA,其中一条是由OTA适配体和富G核苷酸序列组成的单链DNA,另一条是与其互补的单链DNA。当体系中无OTA存在时,两条单链DNA杂交形成双链结构,hemin加入后由于溶解度低而聚集,导致其模拟酶活性降低。而当体系中存在OTA时,适配体可与OTA特异性结合,导致双链解离,富G碱基序列暴露出来,向其中加入hemin后,hemin可与富G序列自组装形成hemin-G-四链体复合物,该复合物呈现强过氧化物模拟酶活性,可催化H2O2氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS),使溶液的颜色由浅绿色转变为深绿色,通过测定420 nm处的吸光度可定量分析OTA含量。在pH 7.0的PBS缓冲体系中,当hemin、H2O2和ABTS浓度分别为1μmol L-1、2 mmol L-1和4 mmol L-1,经37℃反应150 min时,OTA浓度与吸光度呈良好的线性关系,其中OTA浓度范围为0.0010.01μmol L-1,回归方程为y1=4.567x+0.312,OTA浓度范围为0.012.5μmol L-1,回归方程为y2=0.111x+0.356。检出限为70.3 pmol L-1(3S/N,n=10)。将所建立的方法应用于花生、核桃和红豆等10种食品中OTA的检测,发现挂面、面包、红豆、花生样品和鸡饲料中OTA含量均超出国家限量(5.0μg kg-1即0.012μmol L-1),在核桃和花生中进行OTA加标回收试验,回收率在91.9%到109%之间,表明所建立的方法能够准确、灵敏地检测食品中的OTA含量,对食品安全具有重大意义。
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