脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的神经系统损伤，通常导致严重的残疾，其病理生理过程包括连续发生的原发性损伤和继发性损伤。原发损伤造成了损伤局部组织连续性的破坏，而继发损伤则激活了多个化学通路如缺血、缺氧、自由基产生、凋亡／变性受体上调及炎症级联反应，产生比原发损伤更严重的影响。大量实验证实脊髓继发性损伤是引起脊髓进行性功能丧失的主要原因。针对继发性脊髓损伤的研究是对受损脊髓的保护和治疗的研究重点之一。因此研究能减轻脊髓损伤引起的炎症反应和继发损伤，并且具有神经保护作用的药物具有很大的应用前景和优势。 丹参(salvia miltiorrhiza，Danshen)是我国传统中药一味上品。其主要有效成分是水溶性成分，含量最高的是丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)。已有研究证明Sal B具有很强的抗氧化作用和明显的抗炎作用。还有研究表明，复方丹参注射液能减轻脊髓损伤继发损伤，促进脊髓修复。然而，临床应用的丹参注射液中丹酚酸B的含量不高，再加上制药工艺限制，丹酚酸B极易损失或受到破坏，药物的有效成分及治疗效果往往不能得到保证。另外丹酚酸B不仅效价较高，其注射液和丹参注射液相比，也较少引起过敏反应。本室毕小彬首次将丹酸酸B单体应用于脊髓损伤的治疗研究中，将Sal B与骨髓间质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)移植联合应用，发现Sal B能促进移植到损伤部位的MSCs存活，并可发挥促进损伤大鼠功能恢复的协同作用。而高纯度的Sal B单独应用能否对急性脊髓损伤产生神经保护作用，它的作用是否与应用剂量相关呢? 炎症反应是脊髓继发损伤的一个重要部分，在继发损伤发生、发展及演变过程中举足轻重。介导炎症反应发生发展的是一类重要的细胞因子，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一个重要的代表。在脊髓损伤的特定环境下TNF-a早期大量表达并参与了脊髓炎症反应的发生，其作用受体分布广泛。除了诱导炎性反应外TNF-a还能影响生化代谢、组织摄氧能力及组织内压力。本室毕小彬发现，TNF-a对MSCs的体外杀伤作用可被Sal B拮抗，提示Sal B减轻炎症反应的机制可能与对抗TNF-a有关。那么，Sal B在体内产生的神经保护作用是否与干预了TNF-alpha的过表达有关呢? 依那西普(etanercept，ETA)为重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，是一种水溶性TNF-a拮抗剂，可竞争性与受体结合，从而阻断TNF-alpha的活性作用。有实验证实，ETA可减轻急性脊髓损伤的炎症反应，降低组织损伤，并改善预后。这些发现使其也成为干预急性脊髓损伤的备选用药之一。 脊髓损伤有三个临床分期：损伤72h内为急性损伤期，72h至14d为亚急性期，14d至12个月之后为慢性期。脊髓损伤治疗的时间窗选择非常关键，大量研究表明，如不在急性期及时干预，则治疗效果更不理想。炎症反应是机体的自我保护、自我修复的手段，但损伤早期炎症反应的过度激活对机体而言弊大于利。炎症反应是一个可逆的病理生理过程，因此，在急性期给予有效的药物干预，减轻炎症反应，减少继发损伤，从而改善预后，是现阶段脊髓损伤治疗研究的一个重要方向。 综上所述，本实验拟在本室的前期基础上，探讨传统中药单体丹酚酸B在急性脊髓损伤的应用价值，观察Sal B能否对急性脊髓损伤产生神经保护作用，能否减轻脊髓继发损伤，减轻ASCI后的组织损伤和水肿，能否促进损伤后的功能恢复，是否存在剂量相关性；并进一步观察Sal B是否能减少重要炎症因子TNF-a表达和分泌，探讨Sal B抗ASCI继发损伤炎症反应的相关机理，寻找Sal B抗ASCI继发损伤炎症反应的作用靶点，为临床用药提供依据，同时将Sal B与TNF-a拮抗剂依那西普协同应用，观察能甭结合两个药物的优势，更进一步地减轻SCI后的炎性细胞浸润，减少ASCI时过表达的TNF-a。 本实验的研究内容由以下两部分组成： 第1部分：丹酚酸B促进大鼠急性脊髓损伤修复及量效关系探讨 目的：设定2mg／kg，10mg／kg，20kg／kg三个丹酚酸B剂量组，腹腔注射到对脊髓损伤体内，观察损伤后组织损伤情况和损伤局部水肿程度，以及对大鼠功能恢复的影响，探讨丹酚酸B在脊髓损伤治疗的应用价值，并得到初步的量效关系。 方法：48只大鼠随机分为4组：Sal B高剂量组(20mg／kg组)，Sal B中剂量组(10mg／kg组)，Sal B低剂量组(2mg／kg组)，PBS对照组，每组12只。制作大鼠脊髓挫伤模型，治疗组腹腔注射各剂量丹酚酸B，对照组注射PBS。损伤后4小时取损伤节段，用比色法检测髓过氧化物酶活性；损伤后1天取损伤脊髓节段，制成石蜡切片，进行HE染色，用免疫组织化学染色法检测MMP-1、c-Fos抗体表达情况。损伤后3天取损伤节段，用干湿重法评价的水肿程度，并采用BBB评分评价10天内大鼠的运动功能恢复情况。 结果： 1.损伤后4小时髓过氧化物酶活性检测，Sal B治疗组MPO活性下降，与PBS组相比，高剂量组(20mg／kg组)最显著，统计学分析P<0.05。 2.与PBS对照组相比，损伤后1天HE染色切片显示Sal B组治疗后局部组织损伤减轻，炎性细胞浸润数量减少。 3.损伤后1天组织切片免疫组化染色结果显示，Sal B治疗组比PBS对照组MMP-1表达减少，c-Fos表达下调，高剂量组(20mg／kg组)与PBS组相比有统计学意义(P<0.05)。 4.损伤后3天干湿重法评价水肿程度，Sal B治疗组水肿程度轻于PBS组，统计学分析得高剂量组(20mg／kg组)与PBS组相比，P<0.05。 5.从脊髓损伤后第7天起，Sal B组高剂量组(20mg／kg组)和PBS对照组之间的BBB评分有显著性差异(P<0.05)。 6.Sal B减轻脊髓损伤的作用与浓度呈正相关，浓度越高，效应越明显。 结论：Sal B可减少脊髓损伤后的组织损伤，下调损伤相关因子MMP-1和即早刻表达核因子的表达，降低损伤局部髓过氧化物酶活性，减轻组织水肿，并能促进损伤大鼠的功能恢复。同时，Sal B减轻脊髓继发损伤的作用具有剂量相关性，剂量越高，作用更显著。 第2部分：丹酚酸B盐联合TNF-a拮抗剂减轻大鼠脊髓继发损伤 目的：观察Sal B是否通过干预TNF-α表达，从而产生神经保护作用，探讨联合应用Sal B和依那两普治疗大鼠脊髓损伤的可行性。 方法：75只大鼠在脊髓挫伤造模后，随机分为5组：Sal B(20mg／kg)组，依那西普(5mg／kg)组，Sal B+依那西普组，PBS对照组，假手术组，每组15只。损伤后4小时取损伤节段，用比色法检测髓过氧化物酶活性；损伤后1天取损伤脊髓节段，用RT-PCR检测TNF-a的mRNA表达，用Western blot检测TNF-a蛋白表达，另一部分样品制成石蜡切片，进行HE染色，损伤后3天取损伤节段，用干湿重法评价的水肿程度，并采用BBB评分评价10天内大鼠的运动功能恢复情况。 结果： 1.RT-PCR结果灰度分析显示，与PBS组相比，Sal B组TNF-a mRNA表达下降，统计学分析有显著性差异，P<0.05。 2.Western blot结果显示，Sal B组TNF-a蛋白水平表达下调，与PBS组相比P<0.05。 3.Sal B与ETN联用时能进一步减轻继发损伤效应： 1)与PBS对照组相比，损伤后1天HE染色切片显示Sal B+ETN组治疗后局部组织损伤明显减轻，炎性细胞浸润数量减少。 2)损伤后4小时髓过氧化物酶活性检测，Sal B+ETN治疗组MPO活性显著下降，与PBS组相比P<0.01，与Sal B或ETN单独应用时下降更明显(P<0.05)。 3)RT-PCR和Western blot均显示，Sal B+ETA治疗组与Sal B或ETN单独应用组相比，TNF-alpha的下调作用更显著(P<0.05)。 4)salB+ETN组损伤大鼠后肢功能恢复更好，从脊髓损伤后第3天起，和PBS对照组之间的BBB评分有显著性差异(P<0.01)。 结论：SalB能下调TNF-a在mRNA水平和蛋白的表达，当与ETN联合应用时可进一步减少脊髓损伤后的组织损伤，降低损伤局部髓过氧化物酶活性，减轻水肿，并能促进损伤大鼠的功能恢复。二者联合应用可达到更好的疗效。 通过以上实验研究，可得到以下结果： 1.Sal B能减轻脊髓损伤后的组织水肿程度，降低损伤局部髓过氧化物酶活性； 2.Sal B减轻脊髓损伤后的组织损伤和炎性细胞浸润: 1)Sal B能下调代表细胞外基质损伤的指标MMP-1表达； 2)Sal B能减少早刻核因子c-Fos表达，即减轻了损伤对感觉神经元的刺激作用； 3)Sal B减轻急性脊髓损伤的作用与SalB呈剂量正相关表现； 3.Sal B能下调损伤局部TNF-a在mRNA水平和蛋白的表达，与TNF-a拮抗剂联合时下调作用更为明显； 4.Sal B能明显促进大鼠脊髓损伤的功能恢复，与TNF-a拮抗剂联用能增强二者的神经保护作用。