论文部分内容阅读
肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)原发于肾小管上皮(renal tubule epidermis),是成人泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在泌尿系统中仅次于膀胱癌,肾细胞癌的生物学行为及其特征较为复杂,其发生发展的机制尚未完全明确,约有1/3的患者初次就诊时己有不同程度的扩散或转移,约1/3的局限性肾癌患者手术切除肿瘤后仍会出现远处转移,肾癌传统放化疗的效果均不理想,一旦发生转移,患者的5年生存率小于10%,2年生存率小于20%。因此,探索肾癌的发生发展分子机制,寻找有效的诊断、预后分子标志物及分子治疗靶点,具有重要的意义。microRNAs是一类广泛存在动植物细胞内的内源性非编码基因,大小约21-25个碱基,对转录后的基因表达有重要的调控作用,对肿瘤的发生发展具有重要作用。当前研究显示microRNAs对肿瘤的发生发展及凋亡、侵袭等生物学行为具有调控作用,随着对microRNAs的研究进一步深入,microRNAs有望成为肿瘤诊断、治疗及判断预后的靶点及分子标志物。leng等研究发现,microRNA-184在肾癌组织中的表达明显低于癌旁正常肾组织,提示microRNA-184在肾癌中可能受到抑制,但未对其机制进行进一步研究。而在神经母细胞瘤中,已有研究发现microRNA-184具有抑癌基因的作用。通过靶基因预测,我们发现microRNA-184的靶基因为蛋白激酶2(AKT2),Foley等研究发现在神经母细胞瘤中,microRNA-184可以抑制AKT2,影响肿瘤的发生发展。在此基础上,本研究旨在探索microRNA-184对肾癌的作用及其分子机制。第一部分microRNA-184及AKT2在肾癌中的表达目的1研究肾癌组织中的microRNA-184的表达水平2研究AKT2在肾癌组织中的表达水平方法1应用realtime-PCR的方法,检测肾癌组织与其相应癌旁组织中microRNA-184的表达水平。2应用realtime-PCR的方法,检测肾癌组织与其相应癌旁组织中AKT1、AKT2的表达水平。3运用SPSS18.0软件,采用x2检验分析microRNA-184与AKT2在肾癌组织中表达水平的相关性结果1、肾癌组织中microRNA-184的表达显著低于癌旁组织Real time-PCR的结果显示：在新鲜的肾癌组织中,microRNA-184呈低表达水平,在相互配对的6对新鲜肾癌组织与癌旁组织中,microRNA-184的表达水平显著低于癌旁组织。2、肾癌组织中AKT2的表达显著高于癌旁组织,AKT1的表达与癌旁组织中无明显区别。Real time-PCR的结果显示：在新鲜的肾癌组织中,AKT2的表达明显高于配对的癌旁组织,而AKT1的表达在新鲜癌组织与癌旁组织中无明显区别。3、在肾癌组织中,microRNA-184的表达水平高低与AKT2的表达水平高低具有相关性以x2检验统计分析12例新鲜肾癌标本的microRNA-184和AKT2的表达水平,发现其具有相关性,概率P<0.05。结论MicroRNA-184在肾癌中低表达。AKT2在肾癌中高表达第二部分microRNA-184对肾癌细胞中AKT2表达的作用目的研究高表达microRNA-184对肾癌细胞中AKT2表达水平的影响探讨microRNA-184作用于肾癌细胞的分子机制。方法1采用逆转录病毒介导的转染法构建稳定高表达microRNA-184的肾癌细胞株。2采用realtime-PCR和免疫印迹法对高表达microRNA-184后肾癌细胞中AKT1、AKT2、p-AKT1、p-AKT2、PI3K的表达水平进行检测,分析microRNA-184对肾癌细胞中AKT2的作用。结果1上调microRNA-184可抑制AKT2的表达在稳定高表达microRNA-184的实验组中,AKT2的表达明显高于转染无意义片段的阴性对照组和单纯肾癌细胞的空白对照组。2上调microRNA-184可抑制AKT2的活化在稳定高表达microRNA-184的实验组中,P-AKT2的表达明显高于转染无意义片段的阴性对照组和单纯肾癌细胞的空白对照组,提示AKT2的活化受到抑制。结论1microRNA-184可抑制AKT2的表达和活化。2microRNA-184通过抑制PI3K/AKT信号通路,来影响肾癌的发生发展。第三部分microRNA-184对肾癌细胞生物学行为的影响目的研究高表达microRNA-184对肾癌细胞增殖能力的影响。研究高表达microRNA-184对肾癌细胞侵袭能力的影响。方法1应用流式细胞仪法检测高表达microRNA-184后,肾癌细胞的凋亡情况。2应用MTT法检测高表达microRNA-184后,肾癌细胞的生长情况。3应用Transwell法检测高表达microRNA-184后对肾癌细胞侵袭能力的影响。结果1高表达microRNA-184可增加肾癌细胞的凋亡。流式细胞仪检测结果显示,实验组的右下象限细胞群和右上象限细胞群细胞总数明显多于空白组和阴性对照组；阴性对照组和空白组肾癌细胞的凋亡情况无明显差别,说明在高表达microRNA-184后,肾癌细胞的凋亡明显增加,microRNA-184具有促进肾癌细胞凋亡的作用。2高表达microRNA-184可抑制肾癌细胞的生长增殖。MTT法检测细胞生长曲线,结果显示,随着培育时间延长,实验组(高表达microRNA-1841肾癌细胞)的细胞生长速度明显低于空白组(肾癌细胞)和阴性对照组(转染无意义片段的肾癌细胞)。空白组和阴性对照组的细胞生长情况无明显区别。说明microRNA-184可以抑制肾癌细胞的增殖生长。3高表达microRNA-184可抑制肾癌细胞的侵袭能力。Transwell检测结果显示,在实验组(高表达microRNA-184肾癌细胞)中,侵袭入Transwell小室内的肾癌细胞个数明显少于空白组(肾癌细胞)和阴性对照组(转染无意义片段肾癌细胞),说明在高表达microRNA-184后,肾癌细胞的侵袭能力下降。结论1上调microRNA-184表达水平抑制肾癌细胞的增殖。2上调microRNA-184表达水平促进肾癌细胞的凋亡。3上调microRNA-184表达水平抑制肾癌细胞的扩散侵袭能力。