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人DLK1(Delta-like 1 homolog)基因,又称为Pref-1、FA1、pG2,定位于人类染色体14q32,是一个父源表达,母源沉默的印记基因,广泛表达于人胚胎组织,但是仅表达于胎盘,肾上腺和脑垂体等少数成人组织。DLK1蛋白含有383个氨基酸,由胞内区,跨膜区以及膜外功能结构域组成,是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。DLK1蛋白细胞外区拥有6个在结构及氨基酸序列上与表皮生长因子(EGF)具有高度同源的串联重复结构,因此DLK1属于表皮生长因子家族成员。DLK1胞外区的特征性结构域与Notch1配体Delta具有较高的同源性,但是缺少Delta/Notch/Serrate信号分子家族的DSL结构域。DLK1具有复杂的生物学功能:(1)抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化,(2)参与创伤愈合,(3)参与调控造血细胞及肝干细胞的分化成熟,例如:肝卵圆细胞(oval cell)、造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)、B-淋巴细胞以及骨髓干细胞(bone marrow derived stem cell,BMSC)等。DLK1是肝脏早期纤维化的重要因子,而肝纤维化是肝癌的早期病变。虽然DLK1在大部分成人正常组织中处于印记状态,但是近年来研究发现,DLK1能够高表达于脑瘤、肺小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤以及肝细胞肝癌等肿瘤组织,提示DLK1的异常表达与肿瘤的形成密切相关。本实验室利用cDNA芯片技术检测肝癌及癌旁组织基因差异表达发现DLK1在肝癌组织中表达量显著高于癌旁组织。基于这一研究结果开展了以下研究:(1)进一步利用组织芯片技术检测57例原发性肝癌及相应癌旁组织DLK1表达差异,结果发现71.9%(41/57)的原发性肝癌组织高表达DLK1蛋白,提示DLK1与肝癌的形成具有某种潜在联系;(2)为了进一步探讨DLK1与肝细胞癌发生的相互关系以及DLK1在肝细胞癌中的生物学功能,构建了SMMC-7721-DLK1-GFP,SMMC-7721-GFP和Huh7-DLK1-GFP,Huh7-GFP两对过表达DLK1的肝癌细胞稳定细胞株,并用RT-PCR,western blot以及免疫荧光分析技术充分验证了稳定细胞株的可靠性。进一步的研究表明,DLK1能显著增强肝癌细胞SMMC-7721和Huh7细胞的体外增殖速度以及克隆形成能力,能够显著提高两株细胞在裸鼠体内的成瘤能力;(3)为了深入探讨DLK1促进肝癌细胞增殖的分子机制,通过全基因组芯片技术分析比较SMMC-7721-DLK1-GFP和SMMC-7721-GFP两株细胞基因表达谱,发现DLK1过表达诱导283条基因表达上调,180条基因表达下调。随机选取4条上调基因:DLK1,mitogen-activated protein kinase1(MAPK1),tumor suppressor candidate 3(TUSC3),interferon-inducibleprotein 16(IFI16)和3条下调基因:Janus kinase 1(JAK1),matrixmetallopeptidase 16(MMP16)和Caspase-1,应用荧光定量PCR技术进行验证,结果表明基因芯片数据正确可靠;(4)选择IFI16作为进一步研究的候选基因,以RT-PCR、western blot、siRNA干扰实验、报告基因分析实验研究以及MAPK和PI3K信号通路阻滞实验深入研究DLK1对IFI16的调控关系。结果表明:IFI16是DLK1的下游靶基因,DLK1能够激活IFI16上游启动子。siRNA沉默稳定细胞株IFI16表达能够显著下调DLK1诱导的促肝癌细胞增殖作用,说明DLK1促细胞增殖主要依赖于上调IFI16表达。Western blot检测发现,IFI16上调表达能够诱导p21蛋白表达下调。流式细胞仪分析两对稳定细胞株细胞周期分布发现,DLK1过表达细胞具有较高比例的S期分布。此外,DLK1过表达细胞比空载细胞具有更强的抗紫外诱导的细胞凋亡能力。RT-PCR对19对肝癌及癌旁组织样本DLK1和IFI16共表达分析发现,DLK1和IFI16同时上调于12对肝癌组织,提示DLK1在体内也能够调控IFI16的表达。综上所述,通过对DLK1在肝癌细胞中生物学功能的研究,表明DLK1具有显著的促HCC细胞生长作用,IFI16是DLK1的下游靶基因,DLK1促肝癌细胞生长主要依赖于上调IFI16表达。通过对DLK1促进肝癌细胞SMMC-7721和Huh7生长作用功能及机制的研究,加深了对DLK1参与肝癌细胞生长机理的认识。以上结果为进一步深入研究DLK1在肝癌发生、发展中的作用打下了良好的基础。