航天失重环境引起机体生理功能改变,进而影响到药物的药代动力学及药效学特征,给航天用药带来隐患。微重力状态下,维生素机体水平明显降低,机体氧化应激、骨代谢障碍等损伤加重,因此,航天员必须合理有效的补充维生素以维持正常的生理功能。叶酸是一种重要的水溶性B族维生素,以辅酶形式参与体内一碳单位的转移,在氨基酸及核苷酸代谢中起重要作用。微重力环境下机体一旦发生FA缺乏或过量蓄积势必会引起人体内相关组织的损伤。航天员进入太空后,由于昼夜频繁更迭会造成生物钟发生紊乱,容易引起航天员睡眠障碍。酒石酸唑吡坦可选择性与苯二氮?ω₁受体结合,常规治疗期内极少产生耐受性和身体依赖性,是航天员在失重环境下调整睡眠的一线药物。1.目的:考察FA、ZPD在正常和不同时间模拟失重SD大鼠体内的药代动力学参数;测定正常和不同时间模拟失重SD大鼠组织中相关代谢酶的表达以及FA、ZPD在SD大鼠小肠吸收参数,为失重状态下的航天用药提供参考。2.方法2.1 SD大鼠血浆中FA、ZPD的LC-MS/MS测定方法的建立及验证采用岛津公司LC-30高效液相色谱仪,AB公司API 4000质谱仪,AglientC18色谱柱（4.6×100 mm,3.5μm）。FA:流动相为甲醇:0.1%甲酸水溶液（55:45）,进样量5μL,流速0.6 mL·min^-1,样品洗脱时间为6min。采用电喷雾电离源（ESI）,负离子多反应监测（MRM）扫描分析,FA的m/z 442.0→m/z 295.1,内标咖啡因m/z 195.2→m/z 137.9。方法学验证内容主要包括验证回收率、专属性、线性、稳定性、精密度、基质效应以及准确度等相关内容。ZPD:流动相为甲醇:10mM醋酸氨水溶液（85:15）,进样量5μL,流速为0.6mL·min^-1,样品洗脱时间为7min。采用电喷雾电离源（ESI）,负离子多反应监测（MRM）扫描分析,ZPD的m/z 308.0→m/z 235.2,内标咖啡因m/z 195.2→m/z 137.9。方法学验证内容主要包括验证回收率、专属性、线性、稳定性、精密度、基质效应以及准确度等。2.2正常和模拟失重SD大鼠灌胃FA、ZPD的药代动力学研究FA:30只雄性SD大鼠（220±20g）,分为正常,失重状态下1、2、3、4W五组（n=6）。口服灌胃给药,剂量为0.5208 mg·kg^-1。每组灌胃口服给药后10min、20min、40min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h处,眼眶取血0.5-1.0mL之间。随后12000转低温离心10min,吸取大鼠血浆。ZPD:30只雄性SD大鼠（220±20g）,分为正常,失重状态下1、2、3、4W五组（n=6）。口服灌胃给药,剂量为1.0416 mg·kg^-1。每组灌胃口服给药后5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、6h处,眼眶取血0.5-1.0mL之间。随后12000转低温离心10min,吸取大鼠血浆。加入10μL内标溶液,涡旋混匀,吸取360μL甲醇进行萃取,萃取后充分振荡5min,12000转低温离心10min,吸取上清液并抽滤。待样品完全干燥后加入100μL的流动相复溶,充分振荡后离心再取上清液。依照建立的测定方法进行测定。2.3正常和模拟失重SD大鼠组织中FA代谢酶的测定分别取将正常和模拟失重1W、2W、3W、4W SD大鼠肝、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠等组织,加入0.9%NaCl溶液,预处理后分别采用RT-PCR以及Western-Blot法测定上述组织中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、胱硫醚合成酶（CBS）、甲硫氨酸合成酶（MS）的mRNA和蛋白表达。2.4 FA和ZPD的在体肠吸收实验Agelient 1200高效液相色谱仪,Intertsil ODS-3色谱柱（4.6×150mm,5μm）。测定FA流动相为磷酸缓冲液（pH5.0）(磷酸二氢钾2.0g,加入650ml纯水溶解,再加1moL?L^-1磷酸溶液7mL与甲醇270mL,放冷,用1moL?L^-1磷酸溶液或氨试液调节pH值至5.0,用蒸馏水水稀释至1000mL),流速为1.2 mL?min^-1,样品进样量20μL,检测波长280nm。测定ZPD流动相为乙腈（20%）-甲醇（17%）-0.15%磷酸溶液（63%,含0.15%三乙胺）,流速为1.0 mL?min^-1,样品进样量10μL,检测波长为254nm。3.结果3.1 SD大鼠血浆中FA、ZPD的LC-MS/MS测定方法的建立FA在20²000 ng·mL^-1范围内血浆标准曲y=2.22e^-4x+0.00357（r=0.9998）呈现良好的线性关系,ZPD在1²00 ng·mL^-1范围内血浆标准曲线y=2.18e^-2x+0.0932（r=0.9999）呈现良好的线性关系,方法学验证实验结果符合生物样品测定要求。3.2正常和模拟失重SD大鼠灌胃FA、ZPD的药代动力学研究结果FA:模拟失重SD大鼠灌胃给予FA(0.5208 mg·kg^-1)后,结果显示C_max、AUC_（0-t）、T_max以及t_1/2在正常组和失重组组间有显著性差异（P<0.05）;随着模拟失重时间的延长,大鼠血浆FA C_max逐渐降低,模拟失重4W后降至正常组的约50%。AUC_（0-t）在模拟失重2W时最大,随后逐步下降,模拟失重3W、4W分别较正常组下降约20%左右。T_max在前三周呈递增状态,模拟失重3W较正常组增加近80%,模拟失重4W与正常组相近。t_1/2模拟失重4W时明显增加,增大了近101%。ZPD:模拟失重SD大鼠灌胃给予ZPD(1.0416 mg·kg^-1)后,失重状态下1W、4W和正常组SD大鼠的C-T曲线没有明显的差别。C_max、T_max和AUC_（0-t）正常组和模拟失重2W的SD大鼠间有显著差异（P<0.05）,其中模拟失重2W的C_max较正常组下降约25%,T_max增加约98%,AUC_（0-t）下降约16%。正常组和模拟失重3W SD大鼠的AUC_（0-t）有显著差异（P<0.05）,下降约14%。C_max、T_max和t_1/2在正常组和模拟失重3W组间没有显著性差异（P>0.05）。C_max、T_max、AUC_（0-t）和t_1/2在正常组和模拟失重1W、4W组间没有显著性差异（P>0.05）。3.3正常和模拟失重SD大鼠组织中FA代谢酶测定结果5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）,在肾脏中的表达,正常组mRNA以及蛋白含量高于模拟失重组;模拟失重3W SD大鼠肺组织中的mRNA及蛋白含量表达高于其他四组;模拟失重2W SD大鼠十二指肠组织中的mRNA及蛋白含量表达高于其他四组;模拟失重4W SD大鼠的空肠组织中mRNA以及蛋白含量表达最高;模拟失重1W SD大鼠回肠组织中的mRNA及蛋白含量表达高。胱硫醚合成酶（CBS）在肝和肺组织中的mRNA以及蛋白含量表达以失重状态下4W SD大鼠最高;在肾组织中,模拟失重SD大鼠的mRNA以及蛋白含量表达均低于正常组;在十二指肠以及空肠组织中,模拟失重2W SD大鼠的mRNA以及蛋白含量表达高于其他四组,在回肠组织中,模拟失重1W SD大鼠的mRNA以及蛋白含量表达高于其他四组。甲硫氨酸合成酶（MS）,在肝和回肠组织中,模拟失重1W SD大鼠的mRNA及蛋白含量表达最高;在肾组织中,4组模拟失重SD大鼠的mRNA以及蛋白含量表达低于正常组;在肺组织中,模拟失重3W SD大鼠的mRNA及蛋白含量表达高;在十二指肠组织中,模拟失重2W SD大鼠的mRNA及蛋白含量表达高于其他四组;在空肠组织中,模拟失重4W SD大鼠的mRNA及蛋白含量表达最高。3.4 FA和ZPD的在体肠吸收结果5²00μg?mL^-1浓度范围内FA、ZPD呈现较好的线性,FA回归方程Y=32.5053X-75.9772,R²=0.999,平均加样回收率99.87%,该测定条件下精密度为0.36%,稳定性良好。ZPD回归方程Y=27.2334X-10.5722,R²=0.9999,平均加样回收率99.63%,该测定条件下精密度为0.33%,稳定性良好。FA十二指肠肠吸收参数值K_a=1.46±0.28(×10^-4)(s^-1),P_eff=1.96±0.52(×10^-4)(cm?s^-1),ZPD十二指肠肠吸收参数值K_a=1.95±0.37(×10^-4)(s^-1),P_eff=3.24±1.38(×10^-4)(cm?s^-1)。4.结论基于上述研究结果,需要调整人失重状态下的FA、ZPD用量。但是失重状态下的人体药代动力学研究存在很多困难,因此有必要结合正常和模拟失重大鼠的生理参数、FA和ZPD的理化参数、肠吸收参数、药代动力学参数等,建立正常和模拟失重大鼠PBPK模型和正常人体的PBPK模型,推算失重状态下人体的药物用量。