青霉素的发现及其应用标志着抗生素时代的到来，开创了用抗生素治疗疾病的新纪元，抗生素为人类健康做出了重大贡献，随着它的广泛应用，细菌耐药性逐年增加，迫切需要新的抗生素抵抗这些耐药菌株的感染，研究开发抗耐药菌抗生素已经成为最迫切的任务。　　 普那霉素（pristinamycins）的发现为这些问题提供了一个有效的解决途径。它属于链阳性菌素类抗生素，是由Mancy等人于1962年首先从始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）中分离得到，它对革兰氏阳性菌具有很强的杀菌活性，主要用于治疗由包括耐药菌在内的革兰氏阳性菌引起的感染。　　 普那霉素由两类化学性质不同的物质普那霉素Ⅰ（PNⅠ）和普那霉素Ⅱ（PNⅡ）组成，普那霉素Ⅰ为环六肽内酯，普那霉素Ⅱ为多不饱和环内酯。两者联合使用的体外抗菌活性至少是单一组分活性的10倍，这种协同作用同时也扩大了两组分的抗菌谱，使之对细菌表现为杀菌作用，而各组分单独使用则表现为抑菌作用。同时，由于存在两种结构完全不同的组分，该类抗生素耐药性获得较缓慢。这是该新药区别于其他抗耐药菌药物的显著特点之一，另外它是唯一的口服给药抗耐药菌药物。国内有关普那霉素的报道较少，为了使其国产化，填补国内空白，研究开发普那霉素对解决当前耐药菌感染这一重大问题具有重要的意义。　　 目的：对普那霉素的各种分析方法进行研究，建立高效液相色谱法和高效毛细管电泳法，并对其进行定量分析；建立液质联用法（LC-MS）对普那霉素进行定性分析。　　 方法：1.高效液相色谱法。（1）色谱条件的选择：通过选择流动相的组成及配比、流速及柱温，确定最佳的色谱分离条件。（2）系统适用性试验：在已确定的高效液相色谱条件下，以组分普那霉素Ⅰ A和普那霉素Ⅱ A分别考察系统理论板数，并考察普那霉素Ⅰ A和普那霉素Ⅱ A的分离度。（3）专属性试验：在合适的条件下，对普那霉素样品进行热、碱、酸、氧化、光、湿的破坏。通过分析被破坏的样品，测定方法的专属性。（4）精密度试验：取一份对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，计算峰面积的RSD值。（5）稳定性试验：取普那霉素供试品溶液适量，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12小时，取样注入液相色谱仪，记录色谱图，计算峰面积的RSD值。（6）线性与范围：配制一系列浓度的普那霉素对照品溶液，测定峰面积；以浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。（7）检测限的确定：将普那霉素对照品溶液逐步稀释，使峰高为噪音峰高的3倍，此时对应的普那霉素的量即为最低检测限。（8）样品测定：对三批普那霉素样品按照已确定的色谱分离条件进行测定。2.高效毛细管电泳法。（1）通过缓冲液浓度及pH、温度及电压的优化，选择最佳的高效毛细管电泳分离条件，对建立的方法进行方法学验证。（2）系统适用性试验：在已确定的高效毛细管电泳条件下，以组分普那霉素ⅠA和普那霉素Ⅱ A分别考察系统理论板数。（3）专属性试验：在合适的条件下，对普那霉素样品进行酸、碱、氧化破坏。通过分析被破坏的样品，测定方法的专属性。（4）精密度试验：取一份对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，计算峰面积的RSD值。（5）检测限的确定：将普那霉素对照品溶液逐步稀释，测量最高噪音峰的峰高，使样品峰高为噪音峰高的3倍，此时对应的普那霉素的量即为最低检测限。（6）样品测定：对三批普那霉素样品按照已确定的分离条件进行测定。3.液质联用法。采用高效液相色谱-电喷雾-四极杆质谱仪，通过液相色谱条件和质谱参数的优化选择，建立分析普那霉素的方法，确定主要组分和有关物质，最终建立LC-MS法确定主要组分和有关物质与HPLC组分的对应关系。　　 结果：1.高效液相色谱法。（1）色谱条件：色谱柱：Agilent ZorbaxC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A：磷酸盐缓冲液（0.03mol·L-1磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至2.3）；流动相B：乙腈；流速1.0ml/min；在0-22min：B相由32％到32％，在22-40min：B相由32％到80％，在40-50min：B相由80％到32％，在50-60min：B相由32％到32％，线性梯度。柱温30℃。检测波长为210nm，进样量为10μl。（2）系统适用性试验：理论板数按普那霉素Ⅰ A峰计算为6811，按普那霉素Ⅱ A峰计算为11811，普那霉素Ⅰ A与普那霉素Ⅱ A的分离度为2.1。（3）专属性试验：普那霉素样品进行热、碱、酸、氧化、光、湿破坏，破坏产物均可与主要组分峰达到基线分离，表明该方法专属性高。（4）精密度：按上述色谱条件平行测定6次，普那霉素Ⅰ A峰面积的RSD为0.43％，普那霉素Ⅱ A峰面积的RSD为0.32％，表明精密度良好。（5）溶液稳定性：取普那霉素供试品溶液适量，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12小时，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，普那霉素Ⅰ A峰面积的RSD为1.93％，普那霉素ⅡA峰面积的RSD为1.89％。表明溶液在。12h内稳定。（6）线性与范围：普那霉素Ⅰ A在0.01-0.51mg/ml范围内浓度与峰面积呈良好线性关系，普那霉素Ⅱ A在0.03-1.38mg/ml范围内浓度与峰面积呈良好线性关系，其线性方程，普那霉素Ⅰ A为Y=2.856×107X+5.381×104，相关系数r为0.9998，普那霉素Ⅱ A为Y=2.700×107X+3.011×105，相关系数r为=0.9997。（7）最低检测限：以信噪比S/N=3为指标，测得普那霉素ⅠA的最低检测量为0.023ng，最低检测限为0.018％，测得普那霉素Ⅱ A的最低检测量为0.025ng，最低检测限为0.008％。（8）样品测定：对三批普那霉素样品进行测定，测得普那霉素Ⅰ A的含量分别为26.18％、26.23％、26.21％，普那霉素Ⅱ A的含量分别为69.81％、69.30％、69.36％。2.高效毛细管电泳法。（1）最佳的高效毛细管电泳分离条件为：未涂层石英毛细管57cm×50μm（有效长度50cm）；缓冲液为55mmol·L-1磷酸盐缓冲液（55mmol·L-1磷酸氢二钠，用磷酸调节pH2.5）；检测波长为214nm；电压为30kV；温度为30℃。（2）系统适用性：理论板数按组分普那霉素Ⅰ A计算为222400，按普那霉素Ⅱ A计算为145760。（3）专属性：将普那霉素样品进行酸、碱、氧化破坏，降解产物均可与主成分峰达基线分离，表明该方法专属性高。（4）精密度：按上述条件平行测定6次，组分普那霉素Ⅰ A和普那霉素ⅡA各自峰面积的RSD分别为1.40％和2.56％，表明方法精密度良好。（5）最低检测限：以信噪比S/N=3为指标，普那霉素Ⅰ A的最低检测限为0.02％，普那霉素Ⅱ A的最低检测限为0.01％。（6）样品测定结果：三批普那霉素样品在已确定的分离条件下进行了测定，测得组分普那霉素Ⅰ A的含量分别为25.9％，26.2％，26.1％；普那霉素Ⅱ A的含量分别为69.7％，69.6％，69.0％。3.液质联用法。（1）LC-MS条件为：单级四极杆质谱，电喷雾电离源（ESI），正离子检测，电离电压3.0KV；锥孔电压30V；电喷雾接口干燥器（N2）流速280L/h，离子源温度115℃；脱溶剂气温度250℃；流动相A为15mmol·L-1乙酸铵（用乙酸调节pH3.0），流动相B为乙腈；流速为1.0ml/min；梯度洗脱：0-15min，B相为25％；15-22min，B相由25％-32％；22-40min，B相由32％-80％。（2）确定第一个主峰（Rt17.60min）为普那霉素Ⅱ A，第二个主峰为普那霉素Ⅰ A（Rt25.79min）。（3）确定了普那霉素中的4个有关物质，即普那霉素Ⅰ B、普那霉素Ⅰ C、普那霉素Ⅱ B和普那霉素Ⅱ A同系物。（4）确定了LC-MS法中主要组分和有关物质与HPLC中组分的一一对应关系。　　 结论：本文建立了分析测定普那霉素的高效液相色谱法、高效毛细管电泳法和液质联用法，并对新方法进行了方法学验证，用所建立的三种新方法对普那霉素中各主要组分进行了分析测定，为该药的质量控制、稳定性研究提供了新的分析方法和重要数据。