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目的:本研究旨在通过比较FGF-2纳米抗体在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中产量、理化性质以及体外活性的差异,为纳米抗体的研究进一步奠定基础。方法与结果:(1)FGF-2纳米抗体在大肠杆菌中的表达。以实验室保存的菌株为工程菌,经过发酵以及Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得纯度高达90%的NbFGF-2(E.coli)蛋白,蛋白产量约为2.5 mg/L。FGF-2纳米抗体在毕赤酵母中的表达。基因工程技术构建重组质粒p PICzαA-Nb FGF-2和p PICzαA-NbFGF-2-m,电转化至毕赤酵母GS115。经过发酵以及Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得NbFGF-2(Pichia)蛋白,蛋白产量约为100 mg/L。NbFGF-2(Pichia)在摇瓶中表达的最适条件分别为32℃、0.5%甲醇、PH=3以及诱导表达7 d。(2)FGF-2纳米抗体突变体在毕赤酵母中的表达。用Net NGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)对NbFGF-2的基因序列进行分析。NbFGF-2氨基酸序列中第26位为糖基化位点,氨基酸序列-NFS-,因此我们用谷氨酰胺(Q)代替天冬酰胺(N),密码子由CAA替换成ACC。经过发酵以及Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得纯度高达90%的NbFGF-2(m F3)蛋白,蛋白产量约为10 mg/L。NbFGF-2(m F3)在摇瓶中表达的最适条件分别为28℃、0.5%甲醇、PH=3以及诱导表达5 d。(3)FGF-2纳米抗体理化性质的比较。在结合效力实验中,发现NbFGF-2(E.coli)、Nb FGF-2(Pichia)以及NbFGF-2(m F3)的亲和常数分别为8.88×10~8、8.32×10~8和7.49×10~8L/mol,表明不同宿主表达的NbFGF-2与FGF-2有着较好的结合能力。在特异性分析中,Nb FGF-2(E.coli)、NbFGF-2(Pichia)和NbFGF-2(m F3)与FGF-2的特异性结合能力强。热稳定实验表明与NbFGF-2(m F3)相比,在高温处理后,NbFGF-2(E.coli)和NbFGF-2(Pichia)的稳定性更强,即在高温的条件下,NbFGF-2(E.coli)和NbFGF-2(Pichia)的相对活性更高。(4)FGF-2纳米抗体体外活性的比较。CCK8实验表明,NbFGF-2(E.coli)、NbFGF-2(Pichia)和NbFGF-2(m F3)均呈剂量依赖性的抑制FGF-2诱导的HSF增殖,抑制率可达30%,NbFGF-2(E.coli)、NbFGF-2(Pichia)和NbFGF-2(m F3)对FGF-2诱导的HSF增殖的抑制效果并无明显差异。细胞划痕实验表明,NbFGF-2(E.coli)、NbFGF-2(Pichia)和Nb FGF-2(m F3)均呈剂量依赖性的抑制FGF-2诱导HSF细胞的生长和迁移,其中NbFGF-2(m F3)抑制率最高(57.03%)。结论:本论文构建重组质粒p PICzαA-NbFGF-2和p PICzαA-NbFGF-2-m,电转化至毕赤酵母GS115,经过摇瓶培养和亲和层析纯化,获得不同宿主来源的NbFGF-2。ELISA实验结果表明,不同宿主来源的NbFGF-2的理化性质均具有高亲和力和结合特异性,但与NbFGF-2(m F3)相比,Nb FGF-2(E.coli)和NbFGF-2(Pichia)有着更好的热稳定性。体外活性实验表明,NbFGF-2(E.coli)、NbFGF-2(Pichia)和NbFGF-2(m F3)均呈剂量依赖性的抑制FGF-2诱导HSF细胞的生长和迁移。综上所述,FGF-2纳米抗体在毕赤酵母中表达量高、操作简便,为纳米抗体的研究进一步奠定基础。